DNA甲基化與肺癌三級預防及預后的研究進展

溫松，李慎柯，姜東亮

(1.新鄉醫學院，河南 新鄉453003； 2.濮陽市油田總醫院呼吸內科，河南 濮陽 457001)

肺癌是導致人類癌癥死亡的最常見原因之一[1]。國家癌癥中心數據顯示：2015年我國惡性腫瘤發病約392.9萬人，死亡約233.8萬人，其中肺癌是我國惡性腫瘤發病及死亡的首要因素[2]。扼制我國肺癌持續上升的發病率及死亡率，是減輕癌癥負擔的關鍵，而提升肺癌的三級預防水平是有效降低肺癌發病率及死亡率的重要手段。癌癥的發生發展是由遺傳、表觀遺傳、環境等因素相互作用的多步驟、異常累積的結果。1942年Waddington首次確立表觀遺傳學的概念[3]，而隨著研究的深入，現代醫學認為表觀遺傳學是指在基因DNA序列不變的情況下能與基因相互作用且在有絲分裂中可遺傳的變化[4]。表觀遺傳主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑、調控RNA等表觀遺傳修飾，其中DNA甲基化則是基因表達調控最主要、最常見且最具有特征性的表觀遺傳修飾方式[5]。目前大量研究已證實DNA甲基化模式與肺組織癌變及肺癌細胞的侵襲、轉移密切相關[6]。現就DNA甲基化與肺癌三級預防及預后的研究進展進行綜述，以期為肺癌的防治策略提供參考。

1 DNA甲基化

人類基因組中普遍存在DNA甲基化現象，且DNA正常的甲基化狀態對機體細胞正常的結構和功能至關重要[7]。DNA甲基化是指在DNA甲基轉移酶的作用下，將甲基(多以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體)與基因組CpG二核苷酸胞嘧啶的第五位碳原子共價結合的表觀遺傳修飾[8]。人類的基因組中CpG存在兩種普遍狀態：一種是無規律的散落于全DNA鏈；另一種則多位于各基因的順式作用元件，呈高度聚集狀態。這種高度聚集的CpG鏈稱為CpG島，CpG島外的CpG 70%～80%是甲基化的，而CpG島內絕大多數是非甲基化狀態，這種DNA甲基化模式使各基因的表達調控精確有序。人們通過分析體內外細胞DNA甲基化發現，DNA的高甲基化狀態表明基因表達的抑制/沉默/失活，而低甲基化表明基因表達的活躍/活化/激活[9-11]。DNA甲基化不僅參與正常哺乳動物的生長發育，還在癌癥形成過程中起重要作用。有研究證實腫瘤的發生發展與DNA異常的甲基化密切相關，在腫瘤細胞中DNA的異常甲基化具體表現為全基因組水平的低甲基化及順式作用元件內啟動子等處CpG島的普遍高甲基化狀態[12-14]。腫瘤細胞基因組的這種甲基化現象致使腫瘤細胞的基因及染色體穩定性降低，全基因組原癌基因普遍活化，抑癌基因、DNA修復基因表達受抑制或失活。進一步研究發現細胞惡性程度越高，細胞全基因組的低甲基化程度愈顯著[15-16]。現有的研究表明肺部細胞基因組異常的甲基化模式可主動或被動地促進肺癌的發生發展[4-6]，但目前DNA異常甲基化與肺癌的確切關系尚無廣泛共識，DNA的異常甲基化可能是肺癌形成的一種誘因，也可能是肺組織細胞癌變的主要原因或肺組織細胞癌變中的某一環節，仍需進一步研究。

2 DNA甲基化與肺癌的一級預防

當肺部組織細胞暴露于吸煙、顆粒物、石棉、藥物或慢性炎癥等危險因素，常發生包括DNA異常甲基化在內的異常表觀遺傳修飾[17-18]。

從1991年至今，美國癌癥總死亡率下降29%，減少了約290萬癌癥死亡人數，這一良好的成果主要歸功于吸煙人群的減少[19]。吸煙是我國癌癥總負擔的主要構成因素，研究顯示吸煙者和從未吸煙者體內腫瘤的發生發展是由不同的分子和表觀遺傳機制驅動[20]，如Baglietto等[21]將吸煙者與非吸煙者進行對比研究，發現僅吸煙者中的半乳糖凝集素-4基因有顯著的高甲基化和表達下調；Tam等[22]研究表明細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A(cyclin dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A)基因的高甲基化與吸煙量和吸煙時間呈正相關，與戒煙時間呈負相關，且在非吸煙者的肺部組織中CDKN2A基因并未出現高甲基化。另有研究表明，吸煙者體內F2R樣凝血酶/胰蛋白酶受體3、芳香烴受體、脆性組氨酸三聯體、CDKN2A、芳香烴受體抑制因子、miR-487b、DPH6(diphthamine biosynthesis 6)和胰島素樣生長因子Ⅱ信使RNA結合蛋白3基因的異常甲基化均與肺癌風險相關，其中DPH6和胰島素樣生長因子Ⅱ信使RNA結合蛋白3基因的異常甲基化與非小細胞肺癌顯著相關[23]。Stidley等[24]研究發現，多種維生素、葉酸和綠色蔬菜可預防吸煙人群氣道組織細胞基因啟動子的異常甲基化，降低肺癌的發病率。

流行病學研究表明，空氣污染特別是顆粒物質暴露，是獨立于吸煙外與肺癌發生和死亡相關的危險因素[25]。Tantoh等[26]通過對比具有PM2.5差異的中國臺灣北部和中部/南部地區的非吸煙成年人的SRY盒轉錄因子2(SRY-box transcription factor 2,SOX2)基因啟動子甲基化狀況發現，SOX2啟動子甲基化狀態可作為工業空氣污染暴露的潛在生物標志物。此外，SOX2啟動子的甲基化程度可能反映癌癥發生的傾向，從而可以早期篩查健康非吸煙者是否處于癌前病變階段。

不同于空氣污染，盡管吸煙相關的CpG和石棉暴露狀態相關的CpG平均甲基化率不同，但這兩種暴露方式的基因組DNA甲基化譜可能有重疊，表明職業暴露(石棉)與吸煙在肺癌風險方面的相互作用介于相加性與倍增性之間。Kettunen等[27]研究發現肺癌組織中骨形成蛋白4、G蛋白偶聯受體135、ZSCAN31(zinc finger and SCAN domain containing 31)、細胞黏附分子和信號受體、硝酸鹽調控基因2、甲狀腺過氧化物酶和瞬時受體電位陽離子通道3甲基化的變化與患者癌前的石棉暴露梯度有關，表明石棉暴露可能與肺癌相關。另外，鉻及其化合物在焊接、電鍍、顏料、合金制造等化工行業被廣泛應用，研究表明鉻酸鹽暴露可引起肺癌錯配修復基因錯配修復基因1的DNA甲基化累積[28]。

綜上所述，某些基因或基因啟動子的異常甲基化可作為肺癌風險的預測因素及肺癌癌前病變的預測指標，將DNA甲基化的監測運用于肺癌一級預防，可為肺癌的一級預防提供表觀遺傳學的理論依據，從而降低我國肺癌發生率，改變肺癌防治“重治輕防”的現狀，促進肺癌一級預防工作的實施。

3 DNA甲基化與肺癌的二級預防

目前臨床確診的局限期肺癌的5年生存率為57%[19]，轉移性肺癌的5年相對生存率為5%，而大部分患者(57%)在診斷時已經處于疾病晚期[29]。臨床上主要通過CT和血清腫瘤標志物相結合的方法進行肺癌診斷。CT篩查早期肺癌易出現假陽性結果，而臨床開展的肺癌相關血清腫瘤標志物檢測的敏感性及特異性有待提高。即使兩者聯合也無法達到早期發現、精準診斷的目的。

隨著分子診斷技術的不斷革新，通過檢測DNA異常甲基化，特別是基因啟動子內CpG島的高甲基化檢測成為目前腫瘤診斷檢測研究的熱點。相較于DNA低甲基化，高甲基化異常往往較先出現，具有更高的敏感性[4]。與細胞周期調控有關的Ras相關區域家族1A(Ras association domain family member 1A,RASSF1A)、CDKN2A，與轉錄相關的腺瘤性結腸息肉病基因、矮小同源盒基因(short stature homeobox 2,SHOX2)，與細胞凋亡相關的死亡相關蛋白激酶及與DNA修復相關的O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶均是研究相對較多的高甲基化位點。有研究表明，支氣管抽吸物內SHOX2的DNA甲基化狀態可用于肺癌的早期診斷[30]。Kneip等[31]在400多個血漿樣本中研究了SHOX2甲基化與肺癌早期診斷的關系，發現其具有較高的靈敏度(60%)和特異度(90%)。基于上述研究，2012年生物標志物SHOX2甲基化開始應用于臨床。有研究發現，聯合檢測肺泡灌洗液中SHOX2與RASSF1A的甲基化狀態診斷肺癌的靈敏度為71.5%～83.2%，特異度為90.0%～97.4%[32]。Hulbert等[33]通過甲基化特異性聚合酶鏈反應檢測早期肺癌患者痰液中速激肽前體1、SOX17和同源盒A簇17基因啟動子甲基化狀態，對肺癌早期診斷的特異度為98%。Liang等[34]以循環腫瘤DNA作為DNA甲基化的檢測樣本，開發了一種高度敏感的非侵入式診斷檢測方法，可以區分肺癌與良性肺結節，在實驗階段實現了對肺癌的早期診斷。

綜上，某些特定基因的異常甲基化特異性高，且多發生于癌前病變或(和)癌變早期，是腫瘤早期診斷較為理想的潛在標志物，通過對其實驗研究有望形成成熟的無創性肺癌早期診斷技術，提高肺癌早期診斷率，達到早發現、早診治的目的，對于肺癌的二級預防具有重要意義。

4 DNA甲基化與肺癌的三級預防

DNA甲基化可以通過被動和主動的方式去除，表明DNA的表觀遺傳修飾是一種動態可逆的過程[35]，這為從DNA甲基化著手治療肺癌提供了理論上的可能性。但是DNA甲基轉移酶抑制劑在單藥治療肺癌的臨床試驗測試中僅顯示出低活性和低毒性[8]。早期探討的DNA甲基轉移酶抑制劑與化療或與其他靶向治療結合的療效研究絕大部分無實質性進展[36-37]。一項關于DNA甲基轉移酶抑制劑(SGI-110)和組蛋白去乙酰化酶抑制劑恩替諾特聯合治療肺癌的研究發現，該方案可減輕肺癌的腫瘤負荷，并對表觀基因組進行重新編程[38]。而Shieh等[39]研究發現，TMU-35435和5-氮雜-2′-脫氧胞苷在體內外可通過對抑癌基因和Wnt信號通路負調控基因的再激活，達到協同抗腫瘤作用且無明顯不良反應。Niu等[40]通過甲基化敏感酶切計數測序法對全基因組DNA甲基化進行分析，篩選出60個異常甲基化基因并進行相關驗證，揭示了γ氨基丁酸B2受體是表皮生長因子受體19缺失性肺腺癌誘導治療的新表觀遺傳學靶點。

此外，DNA甲基化不僅可以作為肺癌的治療靶點，還有助于選擇與評估治療藥物和手段。例如，T-BOX轉錄因子2亞家族的甲基化狀態可以作為非小細胞肺癌對抗腫瘤藥物5氮雜胞苷反應的預測指標[41]；軸抑制蛋白基因甲基化狀態可能是預測腫瘤放射敏感性的重要因素之一[42]；非小細胞肺癌細胞的miR-9啟動子甲基化狀態可反映非小細胞肺癌的放射敏感性[43]。Grasse等[44]研究發現通過評價低密度脂蛋白受體相關蛋白12 DNA甲基化狀態可以預測肺癌對卡鉑的耐藥狀況。而Zhang等[45]的研究則發現去甲基化藥物阿扎胞苷與組蛋白去乙酰化酶抑制劑曲古抑菌素A的小劑量聯合應用可逆轉順鉑耐藥。抗程序性細胞死亡受體1/程序性細胞死亡配體1單抗是非小細胞肺癌治療的一個重大突破，而DNA甲基化異常是腫瘤對宿主免疫活性反應的重要決定因素[46]。通過測試甲基化抑制劑是否能減少全基因組低甲基化的腫瘤中CpG島的高甲基化狀態或松動異染色質結構以恢復α/β干擾素反應和其他免疫調節途徑，可以決定是否將表觀遺傳療法與免疫療法相結合，以進一步提升抗程序性細胞死亡受體1/程序性細胞死亡配體1單抗藥物對肺癌的療效[47]。目前最先進的表觀遺傳學生物標志物是O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶的甲基化狀態，可以預測膠質瘤對替莫唑胺和卡莫司汀的反應，并已在臨床上成功運用[16]，但在肺癌中尚未見報道。

綜上，特定基因的甲基化有望作為肺癌治療的生物靶點，對肺癌的治療藥物及治療方案進行選擇評估，改善患者的5年生存率。同時，針對肺癌患者DNA異常甲基化的治療方式也將改變肺癌治療的現有模式。DNA甲基化過程的動態可逆為從DNA甲基化入手治療肺癌提供理論上的可能性。

5 DNA甲基化與肺癌的預后

肺癌患者的不良預后與諸多基因的異常甲基化狀態密切相關，這些基因作用于肺癌發生發展的各個方面，包括信息傳遞[跨膜蛋白(transmembrane protein,TMEM)196、TMEM88、軸抑制蛋白、腺瘤性結腸息肉病基因]，DNA修復(人類錯配修復基因1、O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶)，細胞凋亡[死亡相關蛋白激酶、PCED1B(PC-esterase domain containing 1B)、RASSF1A]，細胞分化(SOX2、Tet甲基胞嘧啶雙加氧酶、同源盒A9)，細胞分裂(CDKN2A)，細胞轉移及侵襲(轉化生長因子-β誘導基因、組織蛋白酶抑制劑3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5、上皮鈣黏素、肺癌食管癌缺失基因1、Runt相關轉錄因子3、F2R樣凝血酶/胰蛋白酶受體3、跨膜絲氨酸蛋白酶4、Egl 9同源物2、黏蛋白4)等。進一步研究發現，不同基因的甲基化狀態可以揭示相同組織學類型肺癌患者的預后，而相同基因的甲基化狀態也可以評價多種類型肺癌患者的預后[48]。例如，轉化生長因子-β誘導基因啟動子的甲基化狀態、RASSF1A啟動子的甲基化狀態、同源域蛋白同源盒基因的甲基化狀態均是肺腺癌患者的獨立預后指標[49-51]；TMEM196的甲基化狀態則是肺腺癌與肺鱗狀細胞癌患者共同的獨立預后指標[52]；跨膜絲氨酸蛋白酶4啟動子的低甲基化狀態是早期鱗狀細胞肺癌患者的獨立預后指標[53]；TMEM88啟動子的高甲基化、長散在核重復序列1低甲基化是早期非小細胞肺癌患者的獨立預后指標[16,54]；Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1的甲基化狀態則與絕大多數肺癌的預后相關[55]。

肺癌患者的預后與基因甲基化作用相對應的DNA甲基轉移酶的改變密切相關。Lin等[56]研究發現DNA甲基轉移酶1過表達可引起多個抑癌基因的遺傳改變，而這些抑癌基因的遺傳改變與肺部腫瘤的發生及其不良預后密切相關。Teneng等[57]的研究則表明DNA甲基轉移酶3b過表達可加速致癌物質在細胞系中的轉化，并與肺癌患者的不良預后相關。

甲基化評分是預測肺癌患者預后的指標。Jeschke等[58]研究表明腫瘤浸潤淋巴細胞的甲基化評分獨立于肺鱗狀細胞癌患者的其他預后變量，可以預測不同甲基化評分患者的存活率。而Liu等[59]的研究表明基因組的低甲基化評分是影響肺癌患者總生存期的獨立因素。

綜上，DNA甲基化與肺癌患者的預后密切相關，某些特定基因的甲基化是肺癌患者可靠的預后指標，可以揭示及預測肺癌患者復發轉移的可能性，指導患者的臨床治療，從而延長肺癌患者的總生存期，具有重要的臨床價值。

6 展 望

隨著探索的深入，人們對甲基化與肺癌相關性的認識越發完善，但DNA甲基化與肺癌三級預防及預后的研究仍存在有待解決的問題：①DNA甲基化與肺癌治療的研究多集中于DNA甲基轉移酶抑制劑藥物方向，而肺癌的抗低甲基化藥物以及甲基化雙向調節藥物相關研究較少[60]；②現有的DNA甲基化與肺癌患者預后的研究多為小樣本單中心研究，缺乏綜合性涵蓋所有肺癌類型的大樣本多位點研究，尚未形成系統的預后評價標準；③雖然DNA甲基化測序技術不斷改進，DNA甲基化的檢測樣本來源從組織細胞、肺泡灌洗液、痰液、血液發展到呼出氣冷凝液，但各種檢測樣本和檢測技術均有各自的優劣，暫無系統的標準化檢測方案；④肺癌與DNA甲基化的研究多處于理論研究階段，將DNA甲基化落實到肺癌三級預防及預后的各個方面還需要進行大量的實驗研究及臨床論證。總之，DNA甲基化與肺癌三級預防及預后的研究尚處于起步階段，但也不能忽視DNA甲基化在肺癌三級預防及預后方面的重要研究價值及良好的應用前景。