cGAS-cGAMP-STING 通路在抗病毒中的作用

張 倩，章越凡，李鐵軍 （1. 安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 20012；2. 上海市浦東新區浦南醫院，上海 200125；. 上海大學醫學院，上海 200444）

先天性免疫是機體防御病毒感染的第一道防線也是獲得性免疫觸發的先決條件。當病毒進入機體細胞，胞質內的感受器即被活化，而胞質感受器啟動的信號最終激活STING 受體，誘導產生Ⅰ型IFN 和促炎性因子。2012 年首次報道STING上游通路的關鍵分子是cGAMP，可由胞質內的cGAS 催化生成，cGAMP 作為人體內的第二信使，在天然免疫信號通路中發揮著重要作用。cGAMP可與接頭蛋白STING 結合并活化STING，進一步激活TANK 結合激酶1(TBK1），誘導轉錄因子干擾素調節因子3(IRF3）和NF-κB 入核，產生Ⅰ型IFN和細胞因子，以便機體清除入侵的病原微生物，從而防御各種病毒感染[1]，維持機體健康穩態。cGAScGAMP-STING 通路在抗病毒藥物研發中的作用引起越來越多科學家的關注，本文就該通路的最新研究進展及其在抗病毒中的作用進行系統的梳理概括。

1 cGAS-cGAMP-STING 通路及其發現歷史

STING 是一種完整的內質網（ER）膜蛋白，可通過結合cGAS 合成的2'3'-cGAMP 形成二聚體，招募TBK1，磷酸化IRF3，從而使一系列的信號傳遞下去，最后誘導干擾素的產生。研究者早期認為cGAMP 只存在于細菌等低等生物細胞中，直到2013 年發現哺乳動物細胞中也含有cGAMP[2]。cGAMP 作為第二信使，可以直接結合STING 并活化STING 及其上游關鍵合成酶cGAS。2012 年陳志堅團隊[3]檢測到cGAS 能感知到胞質DNA 的存在，并激活一系列炎癥反應。胞質DNA 與cGAS結合，誘發cGAS 的催化中心發生構象改變，把GTP和ATP 轉化為cGAMP。 Swanson 等[4]發現cGAMP除了激活Ⅰ型IFN 外，還激活了炎性小體，抑制DNA病毒的感染。

有研究顯示，真核細胞中的cGAS-cGAMPSTING 信號通路的抗病毒作用有著古老的進化起源，其進化于微生物對噬菌體的防御機制[5]。越來越多的研究發現該通路在癌癥、抗病毒、抗炎癥反應和疫苗研發等領域都是一個十分具有前景的醫療靶點[6-9]。

2 cGAS-cGAMP-STING 信號通路在抗病毒中的作用

2.1 對DNA 病毒的作用

cGAS-cGAMP-STING 信號通路是被內源性和外源性的DNA 所激活，因此，該通路主要針對DNA病毒起作用。DNA 病毒主要包含皰疹病毒（HSV）、腺病毒（ADV）、偽狂犬病毒（PRV）、痘病毒（Poxvirus）和乙肝病毒（HBV）。cGAS-cGAMP-STING 通路對DNA 病毒的影響作用取決于DNA 病毒種類，另外，相比于抑制病毒的復制，cGAS-STING 通路更傾向通過抑制旁觀者細胞（bystander cell）的傳播來發揮抗病毒作用[10]，如卡波濟肉瘤病毒（KSHV）。在人細胞模型、小鼠細胞模型和小鼠動物模型中，HSV-1 感染后， STING 促使NLRP3（ NOD-like receptor protein 3）定位于內質網，并促進NLRP3 的脫泛素化從而激活炎性小體，使得cGAS-cGAMPSTING-NLRP3 在抗HSV-1 感染中起到了重要作用[11-12]。β-連環蛋白可以促進cGAS-cGAMPSTING 通路中Ⅰ型IFN 的產生，從而更好地發揮抗HSV-1 的作用。HSV-1 的US3 是HSV-1 殼外蛋白，可作為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，HSV-1 可通過US3 高度磷酸化β-連環蛋白以抵消β-連環蛋白的抗HSV-1 作用[13]。Li 等[14]通過IP 和nano-LCESI-MS / MS 分析進行的公正篩選已確定三結構域蛋白家族21（TRIM21）是泛素E3 連接酶，能促進γ-干擾素誘導蛋白16（IFI16）進出，引起IFI16 蛋白進入泛素-蛋白酶體途徑降解，IFI16-K3 / 4 /6R 突變可延長IFI16 的半衰期，誘導更多STING依賴性I 型IFN 和下游干擾素刺激基因（ISGs）表達，從而使細胞對HSV-1 病毒感染更具有抵抗力。Zhou 等[15]的研究發現陰離子通道LRRC8/VRAC是一個跨細胞膜轉運cGAMP 的轉運蛋白，能將HSV-1 感染細胞產生的cGAMP 轉運到非感染細胞中，激活STING 信號和干擾素應答，從而發揮抗HSV-1 作用。

另外，cGAS-cGAMP-STING 通路在抗人類巨細胞病毒 (HCMV)中發揮著重要作用[16]。STING高表達可以顯著降低HCMV 在人成纖維細胞中的復制[17]。

Wang 等[18]研究發現豬干擾素誘導的跨膜蛋白1（pIFITM1）是宿主抑制PRV 感染的限制性因素，而PRV 誘導的pIFITM1 的表達依賴于cGAScGAMP-STING 先天性免疫信號通路和Ⅰ型IFN受體。Cheng 等[19]研究表明，cGAS-cGAMP-STING途徑對于感知鼠痘病毒（ECTV）感染，誘導Ⅰ型IFN 產生以及控制ECTV 復制至關重要。ECTV是一種研究宿主與正痘病毒關系的有價值模型。實驗表明，缺乏cGAS 或STING 的小鼠表現出較低的Ⅰ型IFN 水平和較高的病毒載量，并且對鼠痘更敏感。但是，其對ECTV 反應的作用目前尚不清楚。

Ito 等[20]設計了STING 通路的配體cGAMP作為HBV 疫苗佐劑功效的動物實驗，使野生型（WT）和HBV 轉基因（HBV-Tg）小鼠均接種乙型肝炎表面抗原（HBsAg）和cGAMP，結果發現HBsAg和cGAMP 的疫苗接種顯著增強了WT 和HBVTg 小鼠對HBsAg 的體液免疫和細胞免疫反應。cGAMP 誘導了與輔助性T 細胞1（Th1）和Th2 響應相關的細胞因子的釋放，并誘導激活了淋巴組織中的抗原呈遞細胞。基于以上實驗，Ito 等認為cGAMP 進行疫苗接種可以克服慢性HBV 感染患者的耐受性。

Pepin 等[21]證明cGAMP 依賴連接蛋白轉移至吞噬細胞可以調節抗DNA 病毒效應，使上皮細胞和巨噬細胞共培養，上皮細胞中的cGAMP 可以直接轉移至巨噬細胞胞內，從而反式激活巨噬細胞中STING 信號通路。cGAMP 的轉移依賴于上皮細胞中連接蛋白的表達，抑制連接蛋白的表達會使該途徑的STING 通路的激活減弱。cGAMP 反式激活巨噬細胞又起到了正反饋的作用，放大了STING 通路的抗病毒作用。Wang 等[22]發現通過增加DNA 傳感器cGAS 及其下游銜接蛋白STING的敏感性來對抗DNA 病毒，此反應中Mn2+是必需的。Mn2+增強了cGAS 對dsDNA 的敏感性及其酶促活性，Mn2+還通過增加cGAMP-STING 結合親和力來增強STING 活性。這些發現表明，Mn2+是宿主抵御DNA 病毒的關鍵物質。

2.2 對RNA 病毒的作用

雖然登革熱病毒（DENV）是一種生命周期中沒有DNA 階段的RNA 病毒，它也可以通過STING的蛋白水解作用來操縱cGAS-STING 介導的先天性免疫。Su 等[23]進行的共培養細胞模型發現，隨著人STING 單倍型的不同，STING 對DENV 蛋白酶的敏感性也不同，在DENV 感染后控制細胞因子的產生和病毒復制的效果也不同。外源重新激活的病毒DNA 進一步增強了DENV 蛋白酶與STING 相互作用和裂解的能力。DENV 感染會降低具有蛋白酶敏感性STING 單倍型細胞的宿主先天性免疫。然而，研究者在鼠類和非人靈長類動物中也發現了對登革熱蛋白酶耐受的STING，揭示STING 可能是不同物種限制登革熱病毒復制的一種宿主因子。

Gutjahr 等[24]通過在鼻內單獨給HIV-1 Gag p24納米顆粒（NP-p24）或與2'3'-cGAMP 合用一起接種于CB6F1 小鼠，發現相對于單獨接種NP-p24 的小鼠，用NP-p24 加2'3'-cGAMP 接種的小鼠的病毒復制得到了更為有效的控制，且小鼠的黏膜和全身性HIV-1 Gag p24 特異性IgA 和IgG 滴度非常高，但是，在單獨接種NP-p24 的小鼠中并未檢測到。cGAMP 并行引發體液免疫反應的能力，包括在黏膜表面分泌IgA，可能對某些病毒感染（如HIV-1）有作用。

3 cGAS-cGAMP-STING 信號通路調節劑在抗病毒中的作用

3.1 正反饋調節劑在抗病毒中的作用

Hou 團隊[25]基于細胞分析，從合成的小分子中鑒定出具有吖啶酮骨架的化合物2g、9g 和12b 是STING 激動劑，它們在整個物種中均是STING 的激動劑。其中，12b 活性最好，并且其對人和鼠STING 依賴性信號的誘導均與2'，3'-cGAMP 相似。蛋白質分析表明2g、9g 和12b 可以通過直接與STING 結合從而激活STING 通路，而12b 與STING 的親和力更強。而且與2'，3'-cGAMP 相比，12b 可以誘導各種細胞因子產生更快，更強勁和更持久的免疫應答。基于此，團隊首次成功修飾鼠STING 激動劑以獲得人類敏感性，這些結果表明，12b 是有效的人STING 激動劑。此外，吖啶酮類似物顯示出巨大的抗病毒或抗腫瘤治療潛力。Zhang 等[26]報道了基于細胞的高通量篩選測定法，該測定法可用于鑒定小分子cGAS-cGAMP -STING途徑激動劑，發現6-溴-N-（萘-1-基）苯并[d][1,3]二唑-5-羧酰胺（BNBC）是cGAS-cGAMP -STING途徑的激動劑，不僅可以誘導針對多種病毒的先天抗病毒免疫力，而且還可以刺激適應性免疫應答的激活。Lian 等[27]的研究發現CCHC 型鋅指蛋白3（ZCCHC3）缺乏抑制dsDNA 和DNA 病毒觸發的下游效應基因的誘導，ZCCHC3 直接與dsDNA 結合，增強cGAS 與dsDNA 的結合，這對病毒感染后cGAS 的激活很重要。Ku 等[28]發現了類鼻疽桿菌T6SS5 依賴性細胞融合觸發宿主中的Ⅰ型IFN基因表達，并導致cGAS-STING 通路激活，cGAS和STING 的激活導致自噬細胞死亡。他們提出：cGAS-STING 途徑通過微核形成將異常的細胞融合感知為危險信號，并因此通過自噬死亡的誘導限制異常的被病毒感染的細胞分裂和限制潛在的細胞轉化。Palermo 等[29]的研究發現，STING 激動劑cGAMP 與FDA 批準的組蛋白脫乙酰基酶抑制劑（resminostat）的組合可顯著增加HIV 感染前細胞的HIV 前病毒激活率和特異性凋亡，降低HIV感染細胞的比例并在CD4（+）中央記憶T（TCM）細胞中觀察到了HIV DNA 的總量，該研究通過減少病毒庫并誘導HIV 感染細胞的特異性死亡，代表了一種消除HIV 的新策略。

3.2 負反饋調節劑在抗病毒中的作用

Kawasaki 等[30]發現STING 轉運受到肌管蛋白相關蛋白（MTMR）3 和MTMR4 的調節，而MTMR3 和MTMR4 可以調節PtdIns3P（磷脂酰肌醇）的產生，PtdIns3P 可通過調節STING 轉運來抑制DNA 介導的先天免疫應答，并發揮關鍵作用。Ghosh 等[31]研究發現I 型干擾素誘導型人寡腺苷酸合成酶樣蛋白（OASL）是cGAS-cGAMP-STING途徑的負反饋調節劑，OASL 獨立于雙鏈DNA，直接且特異性地與cGAS 結合，從而與第二信使cGAMP 產生非競爭性抑制，起到負反饋調節cGAScGAMP-STING 通路的作用。Jia 等[32]的研究發現，病毒感染導致胞內脂質過氧化水平升高，產生4-羥基壬烯酸（4-HNE）等脂質過氧化代謝產物，促進STING 羰基化、抑制STING 活化。谷胱甘肽過氧化物酶（GPX4）通過將高反應性脂質過氧化物(L-OOH)轉化為低反應性脂質醇(L-OH)，保護細胞免受脂質過氧化作用并維持胞漿內氧化還原平衡。而GPX4 缺陷通過增強脂質過氧化可進一步促進4-HNE 產生、特異性抑制cGAS-STING 介導的DNA 識別通路，從而抑制抗DNA 病毒免疫反應。Huang 等[33]確定HCMV 蛋白UL31 作為cGAS的抑制劑。UL31 直接與cGAS 相互作用，并使DNA 與cGAS 分離，從而抑制cGAS 的酶功能并降低cGAMP 的產生。UL31 的過表達有效抑制抗病毒應答，而敲低或敲除UL31 則明顯增強了HCMV 誘導Ⅰ型IFN 和下游抗病毒基因的生成。Fu 等[34]的研究結果表明HCMV UL42 也是cGAS依賴性抗病毒反應的抑制劑。

4 總結與展望

近幾年，人們在理解胞質DNA 傳感和信號轉導方面取得顯著進步，尤其是在cGAS 和cGAMP鑒定方面取得重大突破。大量證據清楚地表明cGAS-cGAMP-STING 途徑在抗病毒中的作用，這歸因于胞漿DNA 的識別和Ⅰ型IFN 的產生。cGAMP可有效抗病毒復制，延長病毒滯留時間，延長生存周期，因此，可用于制備治療HBV、HCV 等病毒的藥物。cGAS 激活典型的模式識別受體（PRRs）通路，通過STING 上調IFNs 的表達，進而誘發抗病毒的活性。最近報道，該通路的激動劑具有良好的抗病毒作用，有望進一步開發為抗病毒新藥。

盡管cGAS-cGAMP-STNG 通路被發現和研究多年，但是STNG 信號相關的網絡結構并不完善，其與其他通路如caspase 1/9、STAT、NF-κB 等的交互作用并不是完全清楚，接下來的工作需要完善該信號網絡，為基于靶點的藥物設計提供藥理機制基礎。