基于1H-NMR技術的2型糖尿病代謝組學研究進展

鄭芳萍，高碧珍，陳學勤

(1.福建中醫(yī)藥大學附屬廈門中醫(yī)院內分泌科，福建 廈門 361001； 2.福建中醫(yī)藥大學，福州 350122； 3.廈門大學附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科，福建 廈門 361003)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是一種代謝紊亂的慢性高血糖疾病，其特征為碳水化合物、脂質和蛋白質代謝的改變。據統(tǒng)計，目前全世界T2DM患者達5億以上，而中國約占1/3[1]，已成為繼心腦血管疾病、腫瘤后嚴重危害人類健康的第三大慢性疾病，其導致的多種并發(fā)癥是糖尿病致殘、致死的主要原因[2]。T2DM患者從發(fā)病前期、患病再到出現(xiàn)各種并發(fā)癥，機體內發(fā)生了一系列復雜的代謝變化。以往對于T2DM的研究方法主要以分子生物學和生物化學為主，易忽略整體器官中動態(tài)的代謝變化過程，對該病的發(fā)病機制研究和認識具有一定局限性，也難以做到早期預測。而代謝組學作為一種系統(tǒng)的研究方法，可識別生物體的整體代謝變化，是系統(tǒng)生物學的重要組成部分，近年來在醫(yī)學、藥學、生物學等領域得到廣泛應用[3-4]。其中，核磁共振氫譜(nuclear magnetic resonance hydrogen spectroscopy，1H-NMR)代謝組學能夠對樣本進行動態(tài)監(jiān)測，為T2DM及其并發(fā)癥的預測、作用機制、臨床診斷及藥物療效等的研究提供了新思路。現(xiàn)就1H-NMR技術在T2DM發(fā)病機制、相關并發(fā)癥及中醫(yī)藥治療代謝組學研究中的應用予以綜述，以期為深入研究提供參考。

1 基于1H-NMR技術的代謝組學概述

代謝組學興起于20世紀90年代末，是繼蛋白組學、基因組學后的一門新興學科，用于研究生物體系(細胞、組織或生物體)內源性代謝物種類、數量及變化規(guī)律，可揭示機體生命活動代謝本質[5]。其研究對象主要是分子量為1 000以下的小分子化合物。目前常用的代謝組學技術包括氣相色譜-質譜聯(lián)用、液相色譜-質譜聯(lián)用和核磁共振技術，各有優(yōu)缺點。與質譜相比，核磁共振具有樣品處理簡單、無損傷性、測試手段豐富，定性與定量分析、無偏向性、分析快速等獨特優(yōu)勢，是化合物定性分析中最重要的方式，近年來得到廣泛應用，成為臨床醫(yī)藥研究領域的重要工具[6]。而核磁共振又以1H-NMR和核磁共振碳譜應用最為廣泛。1H-NMR的原理主要是通過利用特定頻率的電磁波，使氫原子發(fā)生能級躍遷，產生的磁頻率信號經過轉換放大在譜圖上以峰的形式體現(xiàn)。核磁定性的基本方式是利用分子中含氫基團的化學位移和譜峰裂分情況，對化合物的分子結構進行判斷。然后通過一系列樣品的圖譜，可以判斷生物體的病理生理狀態(tài)、基因的功能、藥物的毒性和藥效等，并可能找出與之相關的生物標志物和代謝途徑。近年來，采用1H-NMR發(fā)現(xiàn)T2DM潛在生物標志物是代謝組學的研究熱點之一，可以極大提高對T2DM發(fā)生機制的微觀了解，監(jiān)測藥物療效及毒性，從而促進T2DM的預測、診斷、治療等領域的發(fā)展。

2 基于1H-NMR技術的T2DM發(fā)病機制研究

T2DM與體內多種物質代謝紊亂有關，如脂質、氨基酸、碳水化合物等，通過1H-NMR技術有助于了解患者體內代謝物的異常特征，對于進一步認識T2DM的發(fā)病機制，預測疾病發(fā)生發(fā)展至關重要，同時也可為臨床診斷提供新途徑。紅細胞是一種獨特的機體細胞，參與氨基酸等營養(yǎng)物質的運輸和傳遞，而血糖是成熟紅細胞代謝的唯一能源，因此紅細胞的代謝物運輸在T2DM中容易受到損害[7]。Palomino-Sch?tzlein等[8]通過1H-NMR技術研究T2DM患者紅細胞代謝譜，發(fā)現(xiàn)與健康人群不同的代謝產物包括谷胱甘肽、2,3-雙磷酸甘油酸、肌苷酸等氨基酸。但由于血細胞不容易提取分離，而血清代謝組學更容易操作和檢測，因此血清成為代謝組學中最常用的樣本。Del Coco等[9]采用1H-NMR技術區(qū)分了T2DM和T2DM并發(fā)癥之間的血清代謝特征，從T2DM患者中檢測出8種生物標志物，包括丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，而異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、酪氨酸和纈氨酸這5種代謝物可作為T2DM并發(fā)癥患者的生物標志物。可見，T2DM無并發(fā)癥與有并發(fā)癥患者體內的代謝途徑存在差異。此外，由于尿液中含有的化學物種類較多，可以反映代謝紊亂，因此尿液在代謝物譜研究中也是一種關鍵的生物基質。Guan等[10]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠的尿代謝產物與正常大鼠明顯不同，包括與能量代謝、三羧酸循環(huán)和甲胺代謝有關的尿代謝產物。張志軍等[11]應用1H-NMR技術檢測T2DM患者尿液的代謝輪廓，圖譜顯示與T2DM有關的代謝物包括乙酸、牛磺酸、乙酰乙酸、檸檬酸、三甲胺等，表明T2DM的發(fā)生發(fā)展與糖代謝紊亂、氧化應激、氨基酸及脂類代謝異常、維生素缺乏密切相關。Ahola-Olli等[12]用1H-NMR代謝組學測量4個芬蘭人群共11 896人中的229種循環(huán)代謝指標，對基線代謝物與8～15年隨訪期間(392例)糖尿病風險的關聯(lián)進行了調整，結果發(fā)現(xiàn)有113項代謝物與糖尿病有關。

以上研究表明，T2DM患者無論是血清、紅細胞還是人體排泄物中，均可檢測出多種與T2DM發(fā)生發(fā)展相關代謝途徑的生物標志物，這些代謝物可以預示人們患糖尿病風險的趨勢，有助于研究者尋找可預測T2DM致病機制的標志物，同時也擴展了更多了解T2DM代謝途徑的渠道。而全方位的代謝譜分析不僅使疾病發(fā)病機制更加客觀化、可視化、微觀化，還有助于針對風險較高的無癥狀個體進行預防性干預。

3 基于1H-NMR技術的T2DM相關并發(fā)癥研究

T2DM后期可引起一系列并發(fā)癥，易造成器官組織毀損，具有致殘、致死性。由于T2DM的預后高度依賴于并發(fā)癥的發(fā)展，1H-NMR可以輔助疾病進行診斷、分型、分級和分階段，因此用微創(chuàng)技術鑒定T2DM并發(fā)癥進展的生物標志物具有重要的臨床價值。目前臨床多將糖化血紅蛋白作為糖尿病控制的監(jiān)測指標，糖化血紅蛋白水平越高，提示患者發(fā)生糖尿病相關并發(fā)癥的風險越大。然而，糖化血紅蛋白在預測糖尿病相關慢性并發(fā)癥方面無特異性，且不能捕捉到與血糖本身無關的葡萄糖變異性和其他代謝變化，這使得探索新的生物標志物成為預測糖尿病進展的一個重要領域[8]。有研究證實，有糖尿病相關并發(fā)癥患者血漿中的三羧酸循環(huán)、甲胺代謝、能量代謝物和氨基酸受到顯著干擾[13]。近年來，1H-NMR技術在糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)、糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)及腦血管神經病變研究中取得較大進展，成為監(jiān)測代謝物變化和預測疾病發(fā)生發(fā)展的重要手段。

3.1DR DR早期無任何癥狀，隨著病程進展，可導致失明。Santiago等[14]采用1H-NMR技術研究糖尿病對大鼠視網膜中間代謝產物水平的影響，發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠視網膜中葡萄糖顯著增加，乳酸鹽顯著減少，表明糖尿病可能會顯著降低視網膜的糖酵解，從而導致患者視力下降。Jin等[15]對糖尿病伴白內障、DR伴白內障和老年性白內障患者的房水進行了基于1H-NMR的代謝組學研究，結果發(fā)現(xiàn)，乳酸、2-羥基丁酸、琥珀酸等代謝物可能在DR的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。Barba等[16]通過1H-NMR的代謝組學分析糖尿病伴視網膜病變患者玻璃體液的代謝特征，結果顯示乳酸是最豐富的代謝產物，具體表現(xiàn)為乳酸和葡萄糖水平升高，半乳糖醇和抗壞血酸水平顯著降低。由于視網膜、房水、玻璃體等樣本在臨床較難獲得，在研究上存在一定的困難，目前研究較少且不成熟，未來仍需要更多大樣本、多中心研究來支持。但以上基于1H-NMR代謝組學的研究仍可在一定程度上說明DR患者的能量代謝和氨基酸的代謝途徑發(fā)生了改變，這有助于探索DR患者新的發(fā)病機制。

3.2DN DN是糖尿病嚴重的微血管并發(fā)癥之一，也是終末期腎病最主要的原因，嚴重影響患者的生命健康和生活質量。孫立業(yè)等[17]研究認為，DN小鼠體內存在氨基酸代謝和能量代謝異常，從而導致腎臟受損。廖成彬等[18]通過1H-NMR技術檢測尿液代謝組學特征，發(fā)現(xiàn)隨著DN病程的進展，體內能量代謝、氨基酸代謝、脂代謝、三羧酸循環(huán)及腸道菌群會發(fā)生顯著變化。Tian等[19]對從糖尿病大鼠獲得的尿液和腎臟組織樣本進行了基于1H-NMR的代謝組學分析，共篩選出9種與腎功能密切相關的差異代謝產物，它們主要與酮體的合成和降解，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝以及丁酸酯的代謝3個代謝途徑相關，涉及甲胺代謝、能量代謝和氨基酸代謝。魏婷婷等[20]研究認為，DN的發(fā)病與三羧酸循環(huán)、糖酵解途徑和脂類代謝途徑受到不同程度抑制以及糖異生作用增強有關，異常代謝產物包括丙酮酸、乳酸、檸檬酸等，并提出膽堿可能是與DN相關的潛在生物標志物。目前通過1H-NMR技術已識別出影響DN發(fā)生發(fā)展的某些代謝產物，而這些顯著差異的代謝產物能否作為判斷其進展的生物標志物尚未明確，但仍可為未來DN的早期診斷和探索發(fā)病機制提供新方向。

3.3糖尿病腦病(diabetic encephalopathy，DE) 糖尿病可引起認知、記憶等大腦功能障礙以及大腦的神經生理改變，進展為DE，但其潛在代謝機制仍不清楚。有研究顯示，腦病的發(fā)生發(fā)展與腦能量代謝紊亂密切相關[21]，1H-NMR代謝組學可以通過監(jiān)測血清、血漿甚至腦組織、腦脊液的代謝變化特征，揭示疾病病理生理機制。王丹等[22]基于1H-NMR技術發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠不同發(fā)病階段額葉和枕葉兩個腦區(qū)的代謝變化主要涉及能量代謝紊亂、谷氨酸-谷氨酰胺-氨基丁酸循環(huán)抑制、滲透壓調節(jié)增強3個方面。Zheng等[23]認為，糖尿病大鼠的認知功能障礙可能與大腦區(qū)域特定的代謝改變有關，基于代謝通路分析發(fā)現(xiàn)，這些變化涉及能量代謝、神經遞質、膜代謝和滲透壓調節(jié)。DE較輕者會出現(xiàn)反應遲鈍、記憶力下降及認知功能障礙等，但嚴重者會出現(xiàn)腦血栓、腦卒中及老年癡呆等，這可能與機體的代謝發(fā)生改變有關。馬紅等[24]在T2DM合并腦梗死的患者血清中檢測出極低密度脂蛋白、葡萄糖、丙酮酸等特征代謝物，說明脂類代謝、糖代謝、氨基酸代謝的紊亂可能在DE中發(fā)揮作用。一項前瞻性代謝組學研究指出，T2DM患者腦循環(huán)中有氧代謝降低，無氧糖酵解增加，其中T2DM患者腦脊液中的丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、酪氨酸、乳酸、丙酮酸水平顯著升高，組氨酸水平顯著降低，這可為T2DM患者中樞神經病變的代謝紊亂提供臨床參考價值[25]。另有研究表明，慢性應激暴露可介導糖尿病大鼠杏仁核中一些主要的神經遞質和能量代謝相關的神經化學發(fā)生改變，包括乳酸、谷氨酸、谷氨酰胺等[26]。以上研究說明，DE患者不同的大腦區(qū)域呈現(xiàn)不同的代謝特征，表現(xiàn)出特定區(qū)域的糖尿病性腦損傷，這些發(fā)現(xiàn)為T2DM慢性應激相關神經功能障礙的潛在代謝機制提供了新見解。

4 基于1H-NMR技術在T2DM中醫(yī)藥治療中的研究

1H-NMR技術不僅可用于疾病預測、疾病診斷、了解發(fā)病機制，還可以識別藥物作用靶點、監(jiān)測藥物療效以及指導藥物治療等。T2DM是一種可防可控的疾病，在了解其代謝紊亂機制的基礎上，可通過1H-NMR技術針對性監(jiān)測藥物在患者體內發(fā)揮作用的途徑，這對于精準化藥物治療具有重要意義，特別是近年來該技術在T2DM中醫(yī)藥治療方面也有十分重要的應用和突破[27]。Guo等[28]采用基于1H-NMR的代謝組學和網絡藥理學研究黃芪-山藥對T2DM大鼠的降糖作用，代謝譜分析發(fā)現(xiàn)T2DM的調控主要與黃芪-山藥中的18種活性物質有關，其作用靶點有135個，其中有4個靶蛋白可能是黃芪-山藥治療T2DM最相關的靶點。一項研究采用1H-NMR評價不同品種三角蕨的降糖作用，結果發(fā)現(xiàn)治療30 d后糖尿病大鼠的血糖恢復至正常水平，同時生化指標也顯著改善[29]。現(xiàn)代“微生物-腸-腦”學說認為，T2DM發(fā)病與腸道菌群失調密切相關，通過飲食、藥物干預調節(jié)腸道菌群可以改善高血糖狀態(tài)[30]。而通過1H-NMR技術分析腸道代謝狀況，可以間接監(jiān)測藥物對腸道菌群的影響，這對于尋找治療糖尿病的中藥以及療效評價十分重要。有研究通過16S核糖體DNA測序和1H-NMR分析靈芝多糖對T2DM大鼠腸道微生物群和糞便代謝物的影響，結果顯示靈芝多糖能夠恢復T2DM大鼠腸道細菌群落紊亂的氨基酸代謝、碳水化合物代謝、炎癥物質代謝和核酸代謝，從而顯著降低空腹血糖和胰島素水平[31]。另有研究基于1H-NMR技術探討中藥人參煎對T2DM模型大鼠血清和尿液代謝組學的影響，干預后發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠的代謝表型恢復至正常范圍，表明人參煎對T2DM胰島素抵抗大鼠具有治療作用[32]。總之，基于1H-NMR技術的代謝組學研究可將藥物在T2DM患者體內的作用進行微觀化、可視化、簡單化，未來該技術可用于挖掘具有降糖作用的中藥及中藥成分，可能成為闡明藥物作用機制的有力工具。

5 結 語

T2DM雖以高血糖為特征，但機體的整體代謝，如糖、脂類、核苷酸、氨基酸、有機酸等以及與之相關的代謝通路均受到嚴重干擾。而基于1H-NMR技術的代謝組學在T2DM及相關并發(fā)癥的防治研究中展現(xiàn)出巨大潛力與應用價值，隨著1H-NMR代謝組學方法的檢測水平不斷提高，目前已經識別了大量與T2DM發(fā)展密切相關的新型潛在的生物標志物，對T2DM的早期診斷、監(jiān)測病程發(fā)展、預測疾病以及尋找特定藥物產生深遠影響。但現(xiàn)有研究仍存在一些不足：①當前關于1H-NMR在T2DM并發(fā)癥中應用的研究較少，論據不足，未來仍需更多研究證實該技術的價值。②由于代謝譜數據范圍較大，目前尚沒有公認的可作為T2DM及其并發(fā)癥早期預測的生物標志物數據庫，若能進一步驗證這些特異性代謝標志物在T2DM及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過程中產生的影響，盡可能明確統(tǒng)一標準，可為T2DM的早期診治提供有力參考，從而有利于降低T2DM的發(fā)病率和致死率。③現(xiàn)有研究多以疾病某個靜態(tài)代謝狀態(tài)進行研究，而T2DM的發(fā)生發(fā)展是一個動態(tài)過程，有些代謝異常貫穿于整個疾病的始終，因此監(jiān)測整個T2DM發(fā)生發(fā)展過程中的內源性代謝變化顯得尤為重要，對T2DM的預防、診斷和治療具有重要意義。