微RNA參與調控肝纖維化的研究進展

李燚，陳睿，蒙增萍，申涌，陳瑜，劉詠梅

(1.貴州醫科大學醫學檢驗學院，貴陽 550025； 2.貴州醫科大學附屬醫院 a.針灸推拿科，b.臨床檢驗中心，貴陽 550004)

肝纖維化作為各種慢性肝損傷發展的終末階段，已成為威脅全球人口健康的問題[1]。若未得到有效治療，肝纖維化極有可能轉變為肝硬化甚至肝細胞癌，如在肝纖維化早期階段對肝損傷患者進行積極治療，可使肝纖維化消退，逆轉惡性后果，但目前尚未發現通用的特異性藥物，仍只限于針對相應病因進行治療[2]。酒精性及非酒精性肝病、自身免疫性肝炎、病毒性肝炎、藥物和微生物誘發的慢性肝損傷均可導致肝臟病變，使肝臟發生纖維化[3]。肝纖維化以細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的過度累積和肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化為特征[4]。正常生理條件下，HSC處于靜息狀態，其胞質內含有豐富的脂質顆粒，能夠儲存維生素A；肝臟受損后，HSC活化產生多種炎癥因子及相關酶蛋白，參與肝臟的傷口愈合反應，同時靜息HSC轉化為肌成纖維細胞，在肝組織內產生過多膠原纖維、α-平滑肌肌動蛋白等ECM成分，ECM合成與降解的動態平衡被打破，肝組織結構紊亂發生重塑，逐漸發展為肝纖維化[4-6]。研究證明，多種外源性或內源性微RNA(microRNA，miRNA)可參與肝纖維化過程的調節[6-7]。現就miRNA在肝纖維化中的表達調控作用進行綜述，為進一步尋找肝纖維化的治療靶點提供新思路。

1 miRNA的合成及功能

miRNA主要由RNA聚合酶Ⅱ/Ⅲ(DROSHA、DICER)所轉錄，在真核生物胞核內，DROSHA、雙鏈RNA結合蛋白、DiGeorge綜合征關鍵區域8基因及相關蛋白組成微處理器復合體催化RNA生成約70 nt的莖環前體miRNA，即pre-miRNA；而后輸出受體將其輸入胞質，此時DICER酶對pre-miRNA進行再加工，生成miRNA雙鏈體，解旋后其中一條鏈被降解，另一條鏈成為18～25 nt的成熟單鏈miRNA，與AGO蛋白結合形成RNA誘導的沉默復合體，隨后與靶信使RNA(messenger RNA，mRNA)的3′非翻譯區或5′非翻譯區結合，在轉錄后水平抑制靶mRNA的轉錄或翻譯，發揮生物學功能[8-11]。

miRNA有多種表達模式，一個miRNA可以靶向數百個mRNA，且一個mRNA可受數個miRNA的控制，它們共同形成調節網絡，影響多個功能相關的基因表達[12]。miRNA可參與細胞的增殖、分化、遷移、衰老、死亡等過程，肝臟中的miRNA通過調控脂質代謝[13]、HSC的靜默或活化[6]以及其他途徑參與肝內代謝活動或疾病進程。研究證實，miRNAs與病毒相關的肝纖維化[14]、寄生蟲性肝纖維化[15]、酒精性肝病[16]等肝臟疾病密切相關。

2 miRNA在肝纖維化中的表達

肝纖維化是一個涉及多病因、多信號的復雜肝臟損傷后的修復反應，也是一個動態的、可逆的病理生理過程，其基因表達調控的變化與miRNA的網絡調節相關。肝損傷后循環中的特異miRNA可作為早期診斷肝纖維化的標志物，此外還可通過動態監測隨肝臟疾病進展變化的miRNA監控疾病狀態[17-18]。循環中的miRNA在細胞死亡過程中通過外泌體或微囊泡分泌運輸，肝臟中各類肝細胞釋放含有miRNA的外泌體或微囊泡后，被鄰近細胞攝取或進入循環，傳遞調控信號；進入血液、尿液、腦脊液等體液中的miRNA因被包裹而較其他單獨存在的miRNA更具穩定性[19-21]。

不同miRNA在肝纖維化的發展中起促進或抑制作用，表現為在肝組織、肝細胞、循環中的上調或下調，目前發現的在肝纖維化或其他肝病進展中上調的miRNA包括miR-122[22]、miR-221/222[23-24]、miR-192[25]、miR-16、miR-146、miR-571[26]、miR-34a[27]等，下調的miRNA包括miR-29a[28]、miR-30a[29]、miR-542、miR-652[26]等，有些miRNA(miR-29b、miR-155等)在不同情況下表現為抗纖維化或促纖維化的潛能，對肝纖維化進展具有雙重作用。

3 miRNA在肝纖維化中的調控

不同miRNA表達模式所形成的網絡式調節能夠特定地改變大多數急性或慢性肝臟疾病，在肝纖維化中，miRNA通過調控不同信號分子或改變疾病某一過程表現出抵抗或促進肝纖維化的能力，同時miRNA在外源性藥物或抑制劑干擾下的表達也能作為肝纖維化治療的潛在位點。

3.1miRNA促進肝纖維化 miR-155在炎癥反應中起重要作用，可參與脂肪性肝炎和肝纖維化等肝損傷過程，具有促進與抑制纖維化的雙重作用[30-32]。Bala等[32]發現，酒精性肝病小鼠模型的miR-155上調，而敲除miR-155后，小鼠肝細胞與巨噬細胞中過氧化物酶體增殖物激活受體反應元件和過氧化物酶體增殖物激活受體α基因結合增加，肝臟炎癥減輕，肝纖維化緩解。此外，在酒精性肝炎大鼠中，沉默miR-155可上調細胞因子信號轉導抑制因子1，使促分裂原活化的蛋白激酶信號通路失活，抑制酒精性HSC增殖，促進凋亡[31]，提示外源性miR-155的表達降低可作為減輕肝纖維化的一種治療方式。

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染時，肝臟大量產生miR-192，Kim等[25]采用體外共培養HCV感染肝細胞及人源HSC系LX-2細胞的實驗發現，HCV誘導肝細胞產生并釋放外泌體miR-192，隨后激活HSC，同時外泌體miR-192通過轉化生長因子(transforming growth factor,TGF)-β1刺激人原代HSC轉分化為肌成纖維細胞。病毒誘導的miR-192通過下調鋅指E盒結合同源蛋白1刺激TGF-β1轉錄增加，miR-192與TGF-β1形成的正反饋環放大了TGF-β1在病毒感染中的促炎作用[33]，提示病毒可誘導miR-192產生，并促進病毒性纖維化的發展。

miR-199在肝病發展中起正向作用。一項埃及的臨床研究顯示，HCV感染患者血清miR-199顯著上調，血清miR-199水平診斷晚期肝纖維化的靈敏度和特異度均較高[34]。Yang等[35]發現，TGF-β誘導轉錄因子Twist1表達增加，通過驅動HSC中miR-199a-3p上調，促進纖維化的發生發展，該效應由miR-199a-3p靶向抑制小窩蛋白2使TGF-β信號增強而產生，提示沉默miR-199可能是有效治療肝纖維化的方法之一。

miR-34a/沉默信息調節因子1/p53信號通路在肝纖維化中發揮作用。Tian等[36]在共培養的肝細胞與HSC中發現，肝細胞中miR-34a/沉默信息調節因子1/p53信號通路激活后，凋亡肝細胞及活化HSC增加，肝纖維化發展。miR-34a與慢性丙型病毒性肝炎進展為早期或晚期肝纖維化具有相關性。Li等[37]的研究顯示，慢性丙型病毒性肝炎患者血清高miR-34a水平與低生存率相關，肝纖維化程度越重，miR-34a水平越高，沉默信息調節因子1下調以及乙酰化p53上調越顯著，慢性丙型病毒性肝炎向肝纖維化進展越迅速，說明miR-34a可作為預測肝纖維化發展的指標。

3.2miRNA抑制肝纖維化 miR-122是成人肝組織中表達最豐富的miRNA，約占肝臟總miRNA的70%[38]。Cheng等[39]發現，miR-122可抑制TGF-β1/Smad4信號誘導的上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程，并負向調控HSC的活化。miR-122也可通過參與肝臟慢性炎癥及脂質代謝起作用，Satishchandran等[16]發現，酒精可使人和動物肝臟中具有肝細胞特異性的miR-122表達減少，進而促進缺氧誘導因子-1α與過氧化物酶體增殖物激活受體γ的表達，導致脂肪變性及炎癥發生，使酒精性肝病逐漸發展為肝纖維化，而miR-122水平的恢復可抑制以上途徑，改善酒精性肝損傷。另有研究表明，抑制肝臟模型中miR-122的表達可導致肝臟炎癥、壞死、脂肪變性[40]，提示維持肝臟miR-122較高水平有利于延緩肝炎患者的肝纖維化進展。

纖維化肝臟中miR-29家族(包括miR-29a、miR-29b、miR-29c)顯著下調，其中miR-29a表現最明顯。miR-29a通過抑制CD36改善高脂飲食誘導肝纖維化模型小鼠皮下、內臟和腸道脂肪累積和肝細胞的脂肪變性，使小鼠體重減輕，而過表達miR-29a在EMT和肝纖維化中發揮保護作用[28]。Matsumoto等[41]對四氯化碳以及硫代乙酰胺肝纖維化小鼠模型的實驗分析發現，miR-29a可直接靶向抑制Ⅰ型膠原A1和血小板源性生長因子C信使RNA的表達，減少ECM的產生，抑制細胞增殖和分化，同時miR-29a可通過提高胱天蛋白酶9的活性誘導LX-2細胞的凋亡，改善小鼠模型的肝纖維化程度。Yang等[42]證明，靜脈注射miR-29a可通過直接靶向抑制磷脂酰肌醇-3-激酶p85α減輕膽管結扎誘導的膽汁淤積性肝損傷和纖維化。由此可見，在不同致肝損傷物誘導的肝纖維化模型小鼠中，miR-29a均表現出對肝纖維化過程關鍵步驟的抑制作用，提示可使用一種miRNA改善不同原因引起的肝纖維化。

miR-30a可減輕肝纖維化。Chen等[29]發現，通過結扎膽管或四氯化碳誘導而建立的肝纖維化模型的miR-30a表達下調，而靶蛋白Beclin-1表達增加。采用miR-30a模擬物使miR-30a在體外培養HSC中高表達，進而使ECM產生減少，HSC脂質累積增加，而敲除Beclin-1后，纖維化標志物α-平滑肌肌動蛋白、Ⅰ型膠原和組織金屬蛋白酶抑制劑1、自噬標志物微管相關蛋白1輕鏈3Ⅱ/Ⅰ蛋白均表達下調，說明miR-30a可抑制Beclin-1介導的自噬，可在一定程度上發揮抗纖維化作用[29]。miR-30a過表達可通過靶向結合Snail抑制EMT過程，進而抑制HSC活化[43]，天然藥物胸腺醌可上調miR-30a的表達，通過作用于EMT發揮抗纖維化作用[44]。

miR-155具有抗纖維化的潛能。研究表明，miR-155在肝硬化患者血清及活化的HSC中表達降低，miR-155通過靶向激活血管緊張素Ⅱ受體1與T細胞因子4參與EMT和胞外信號調節激酶1信號通路；而在HSC-T6細胞中，轉染的miR-155可通過促進胱天蛋白酶3表達并降低B細胞淋巴瘤-2水平，抑制活化的肝成纖維細胞增殖，并誘導HSC凋亡，提示miR-155可能成為肝纖維化治療的潛在靶標[45]。

此外，其他miRNA亦可抑制肝纖維化發展，如miR-194能夠抑制HSC的活化和增殖，抑制癌基因蛋白激酶B2，部分減輕肝纖維化[46]；中性粒細胞來源的miR-223通過抑制非酒精性脂肪性肝炎向纖維化的發展發揮抗炎作用[47]；miR-876通過骨膜素抑制EMT狀態以及肝纖維化向肝癌的發展，影響肝細胞癌的侵襲、轉移和預后[48]；miR-455-3p通過抑制熱激轉錄因子1的表達減緩HSC的激活及肝纖維化[49]。以上研究提示，內源性或外源性干擾miRNA表達可作為治療肝纖維化的潛在途徑，為臨床藥物開發提供基礎。

4 基于miRNA診斷治療肝纖維化

4.1基于miRNA的肝纖維化評估 正確有效的肝纖維化評估有利于預測、治療、監測慢性肝病。肝臟組織活檢為有創檢查，具有一定風險，雖有助于明確肝病類型及進展，但只能檢測某一時間點的情況，結果具有一定的主觀性[50]。基于血液生物標志物和瞬時彈性成像技術的非侵襲性檢測手段對纖維化程度隨時間的細微變化不敏感，難以判斷疾病進展過程[50]。

血液或其他體液中的miRNA隨時間變化，且不同疾病進程具有特征性改變，如血清外泌體miRNA可用于肝纖維化疾病分級，外泌體miR-92a-3p、miR-146a-5p和miR-532-5能夠區分Ⅰ～Ⅲ級肝纖維化患者以及健康者；輕型(0～Ⅰ級)和重型纖維化(Ⅱ～Ⅲ級)可通過血清外泌體miR-146-5p水平進行判斷[15]。Abdel-Al等[23]的實驗表明，在HCV相關肝纖維化肝組織中，miR-16、miR-146a-5p、miR-122、miR-222表達上調，且在早期和晚期肝纖維化中均顯著上調；與miR-16、miR-146相比，miR-221/222診斷晚期肝纖維化的靈敏度和特異度更高，可作為預測HCV誘導的肝纖維化和預后的生物標志物。

miRNA能夠發揮抑制或促進肝纖維化的作用，且循環miRNA水平在肝纖維化發展中的變化趨勢穩定[19-22,25,28-29]，故檢測循環miRNA有助于更好地診療疾病，且檢測標本易收集、對患者無傷害、風險較低或無風險，可作為疾病進展及預后判斷的指標，并具有肝組織活檢、血液生物標志物、瞬時彈性成像等臨床常用指標的優點[50]。由于體液miRNA水平受患者機體內環境的影響，同一時間個體間以及不同時間同一個體的miRNA差異較明顯，故同一疾病不同病程不同患者體液miRNA水平的變化難以統一，未來不同人群miRNA的標準檢測仍需深入研究。

4.2基于miRNA的肝纖維化治療 目前，肝纖維化的治療策略是針對原發病的病因治療、抗炎治療以及其他抗纖維化治療[3]。由慢性病毒性肝病引起的肝纖維化可使用抗病毒藥物，在肝炎病毒慢性感染階段直接使用抗病毒藥物，使病毒產生持續性病毒應答，可直接顯著減輕肝炎病毒感染程度，臨床常用利巴韋林、恩替卡韋等抗病毒治療藥物[51-52]，但由于藥物在體內循環運輸過程中可能有損失，不同患者的有效治療藥物劑量不同，故給藥方式及治療劑量應個體化。靶向抑制與HCV感染進展緊密相關的miR-122、miR-192、miR-221/222等可能是一種有效的治療方式[23,53]。對于非酒精性或酒精性脂肪性肝病患者，可早期進行人為干預，如改變生活方式、保持正常體重等；對于自身免疫性肝炎患者，可使用免疫抑制劑等。其他可減輕肝纖維化狀態的治療方式包括誘導活化HSC凋亡[20]、抑制活化HSC的細胞因子[54]等。miRNA可通過TGF-β1/Smads信號、核因子κB信號及胞外信號調節激酶發揮抗炎、抑制HSC活化、減少肝細胞凋亡的作用，進而減輕肝纖維化[10]，與Sun等[55]從老鼠簕(Acanthus ilicifolius)篩選的有效成分4-羥基-苯并唑-2-酮在肝纖維中的作用類似。某些藥物的肝臟毒性作用較大，其應用受限，同時針對肝纖維化原發病的治療藥物的有效性隨時間及病程變化而逐漸降低，因此以miRNA為基礎開發安全有效的新型治療藥物在控制肝纖維化方面有廣闊的應用前景[10]。

5 小 結

miRNA調控網絡在肝纖維化發生發展過程中起重要作用。隨著高通量組學及其他相關技術的發展，有病理意義且在肝臟疾病中具有明確特異性調節功能的miRNA不斷被發現，這些miRNA具有肝纖維化診斷分級、治療及預后監測的潛力，對未來臨床治療方案的制訂有一定幫助。目前，肝纖維化中miRNA作用的研究多集中于單個miRNA及其具體機制的臨床前作用，對臨床中miRNA調控作用的研究較少，miRNA作為新的非侵入性肝纖維化早期診斷生物標志物的有效性、特異性、敏感性還需進一步驗證。