外泌體在骨關節炎發病及治療中的作用研究進展

2021-11-30 10:08:35王若欣

醫學研究雜志 2021年5期

王若欣張勉

骨關節炎(osteoarthritis，OA)又稱退行性關節炎，主要表現為關節軟骨破壞、軟骨面出現垂直裂隙且伴有軟骨細胞/滑膜細胞反應性增殖、關節囊中有骨及軟骨碎片等，但OA的具體發病機制仍不明確。目前對于OA的早期治療以非甾體類藥物治療為主，但藥物治療不良反應明顯且最終仍無法避免關節軟骨的退變。晚期以手術治療為主，但是手術創傷大且費用高昂[1，2]。近年來，以外泌體為對象的基礎及臨床應用研究逐漸興起，越來越多的研究表明，外泌體在OA的發展和治療中都有著極其特殊的作用，對外泌體的深入研究為明確OA的發病機制以及創新治療方式提供了新的前景。

一、骨關節炎定義及組織改變

一般而言，軟骨承受超負荷后會引起表面部位的變薄與結構破壞，隨著時間的推移關節軟骨會進一步凹陷破損，脫落的軟骨碎片進入關節腔內，引起后續的一系列惡性反應最終形成骨關節炎。正常軟骨由軟骨細胞和細胞外基質(extracellular matrix，ECM)組成[3]。在發生OA的關節軟骨中，軟骨細胞損傷和修復失衡引起ECM結構破壞。在溶酶體蛋白酶以及膠原酶的作用下，軟骨基質內的蛋白多糖成分急劇減少、膠原纖維變性，同時軟骨細胞退化且功能受損失去合成ECM的能力。隨著關節軟骨的病變，軟骨承載和緩沖力量的能力下降，軟骨下骨逐漸暴露并承受較大應力和摩擦力，進而出現局部骨折、骨壞死，而關節面和周圍的骨質代償性增生形成骨贅，同時可能會伴隨骨囊性病變發生[4]。

二、外泌體的基本結構與功能

外泌體(exosomes，EX)是一種由磷脂雙分子層膜包裹的囊泡，直徑通常在30～120nm左右，幾乎所有細胞都能夠分泌[5]。外泌體膜上富含膽固醇和鞘磷脂。此外，膜上還富含具有交換以及融合作用的膜聯蛋白、參與外泌體運輸的四跨膜蛋白家族(CD63、CD81、CD9等)、熱休克蛋白家族以及一些細胞特異性蛋白質。外泌體內則含有眾多代謝相關酶類、核糖體蛋白、信號轉導因子等蛋白質，以及mRNA和miRNA，這些生物活性物質分別對不同的細胞發揮不同的生理作用。外泌體由宿主細胞釋放，作用于各種受體細胞，在免疫應答、腫瘤發展、代謝調節等眾多生理、病理過程中均起到重要作用。通過外泌體進行細胞間信息交流無需細胞直接接觸，外泌體同靶細胞上的膜受體結合，激活胞內信號轉導通路進而改變受體細胞的活動與功能。此外部分外泌體膜能同靶細胞膜融合使外泌體內的生物活性物質直接進入受體細胞內發揮作用[6]。

三、外泌體在骨關節炎進展中的作用

OA的發生、發展受到多種因素的影響，目前外泌體作為熱門研究方向，為骨關節炎的發展機制提供了新的研究方向。

1.外泌體對關節軟骨的影響：關節內存在促炎性細胞因子、抗炎性細胞因子和雙向作用因子，三者的動態平衡維持著關節軟骨正常的生理代謝。當此動態平衡失調后，將會引起軟骨細胞代謝異常，誘發和促進OA。實驗證實，在關節腔中存在外泌體參與的成纖維細胞與軟骨細胞之間的正反饋通路，促進炎癥的發生[7]。當用白細胞介素(interleukin，IL)-1β處理滑膜成纖維細胞分泌的外泌體刺激OA軟骨細胞，能夠顯著上調基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-13和結合蛋白序列的解聚蛋白樣金屬蛋白酶(adisintegrin and metalloprotease with thrombospondinmotifs，ADAMTS)-5的表達，同時減少Ⅱ型膠原的分泌。此外，IL-1β處理后成纖維細胞分泌的外泌體中含有較豐富的IL-6、MMP-3、血管內皮生長因子，這些細胞因子在OA早期發揮重要的促進病變發展作用。

此外，IL-1β刺激成纖維細胞后有340個miRNA被上調、24個被下調，在其產生的外泌體中有11個miRNA被上調、39個被下調，在細胞和外泌體內均被上調的miRNA有5個，這說明外泌體中的miRNA種類是細胞選擇性的結果。目前研究最廣的miR-4454受腫瘤壞死因子α刺激增多，miR-720在促進細胞遷移中發揮作用[8，9]。成纖維樣滑膜細胞分泌的外泌體可影響軟骨細胞的增殖、分化、遷移及分泌活動，在促進軟骨細胞凋亡的同時減少蛋白聚糖的產生，增加細胞外基質成分的降解。以上研究表明，外泌體可減少正常軟骨細胞數目、降解細胞外基質，影響關節軟骨的正常形態以及功能。

2.外泌體可作為OA潛在生物學標志物：骨關節炎是漸進性退行性疾病，目前主要檢測依靠患者自身感覺、影像學診斷和臨床特征性癥狀，仍缺乏統一的診斷學標準。現有的臨床診斷以及影像學檢查對于患者早期病癥缺乏敏感度，因此能夠明確的便于檢測的早期生物學改變，對于OA的診斷有重要意義。

細胞產生并釋放到體液的外泌體能夠反映細胞的生理情況，故其有望作為部分疾病的發生、發展的生物學標志物[10]。在關節退行性病變早期，滑液中的Ⅱ型前膠原C端前肽表達增加，濃度升高，可預測早期的OA發生。而血清Ⅱ型膠原C末端肽和C端前肽濃度的動態聯合檢測對于OA的早期診斷以及嚴重程度預判有參考價值[11]。此外，ADAMTs與OA發展有關，早期OA患者中ADAMTs4水平高于中晚期患者，與ADAMTs1、3、5正好相反。滑液中提取的外泌體內高于正常濃度水平的miR-200C以及滑液中的相關促炎性細胞因子都可以作為標志，而根據最新研究顯示，滑液中提取出的外泌體內lncRNA PCGEM1可能是OA發展早期和晚期的區分標識[12，13]。雖然外泌體具有作為生物學標志物的潛力，但是到目前為止僅有少數因子有應用價值。此外，軟骨組織、滑膜組織以及軟骨下骨產生的外泌體之間也會相互影響，再考慮到性別、年齡、種族、發病部位等因素，以及數量龐大的不同因子，還需要進行更多的檢測與實驗。

四、外泌體在骨關節炎治療中的作用

1.干細胞外泌體對OA治療的積極作用：目前很多研究表明間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSCs)來源的外泌體(MSCs-EX)對治療OA有積極作用[14]。Zhang等[15]研究證實MSCs-EX能夠從多個方面緩解OA的發展。間充質干細胞外泌體通過介導動態修復進程加快軟骨修復，在大鼠骨軟骨缺損處加入MSCs-EX處理后新軟骨組織形成顯著增多，s-GAG和Ⅱ型膠原蛋白的表達顯著提升，同時Ⅰ型膠原蛋白表達下降，軟骨深層組織中可觀察到有增大間隙的肥大軟骨細胞，軟骨下骨完全恢復，新生軟骨組織同原組織結構整合良好。MSCs-EX增強細胞增殖并減少細胞凋亡，MSCs-EX處理后軟骨組織和上覆滑膜組織中PCNA陽性細胞顯著增加，同時凋亡軟骨細胞數量明顯減少。Liu等[16]也研究發現在小鼠OA模型中，MSCs-EX通過ln-cRNA-KLF3-AS1/miR-206/GIT1軸促進OA中軟骨細胞的增殖并且抑制其凋亡。MSCs-EX促進M2型巨噬細胞分化且同時減少M1型巨噬細胞和炎性細胞因子分泌。

MSCs-EX主要通過腺苷介導的AKT和ERK信號通路調節軟骨細胞的生存、增殖以及基質合成[17]。當外泌體作用于軟骨細胞時，AKT和ERK信號通路在1h內開始磷酸化并在6h達到巔峰，說明MSCs-EX能夠很快地激活軟骨細胞，促進軟骨細胞代謝活動快速增加和相關基因表達。此外，軟骨細胞通過攝取外泌體還可以對自身活動產生影響。Zhang等[15]研究發現，軟骨細胞在遇到MSCs-EX后會快速將其吞入胞內，并且大部分吞入的外泌體會較長時間集中存在于胞質內，同時細胞增殖相關的基因如生存素、Bcl-2、FGF-2等的mRNA水平會在細胞同MSCs-EX直接接觸24h后明顯上升。同時與細胞遷移、分化、基質合成等活動相關的基因表達在4h后也有顯著提高。還有研究發現MSCs-EX可抑制IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎性細胞因子的表達，同時促進IL-10等抗炎性細胞因子的表達，因此MSCs-EX也具有一定的抗炎潛能。

2.外泌體miRNA對OA治療的作用：外泌體中含有大量的miRNA，miRNA通過調節組織中各種細胞的基因表達影響細胞的各項活動。外泌體miRNA除了作為OA早期生物學標志物的潛在價值外，還有治療的潛在可能。

在MSCs-EX內含有大量的miRNAs，可調節多種重要的細胞信號轉導通路，較為主要的有ATK、ERK、SMAD等[18]。miR-125b和miR-320能夠通過下調ADAMTs而減輕OA的發展[19]。有關研究表明miR-23b是人間充質干細胞向軟骨細胞分化過程中有重要調節作用，miR-221和miR-92a則有可能在促進軟骨細胞增殖和分化方面發揮作用[20]。此外，miR-140、miR-30a、miR-558、miR-476b和miR-142-3p也可以在抑制IL-1β和TNF-α這兩個促炎性細胞因子的表達，同時抑制它們下游的信號轉導通路。

對外泌體進行人工修飾或干預后治療OA目前也備受關注。Jones研究顯示滑膜間充質干細胞具有使軟骨再生的組織特異性，對于軟骨再生具有重要的潛力。外泌體是Wnt信號通路中的一種潛在的細胞外運輸載體，外泌體中的Wnt5a/b通過激活Hippo-YAP信號通路中的YAP(yes-associated protein)，對抗經典的Wnt/β-catenin信號，減少包括轉錄因子SOX9在內的主鏈β-catenin的基因表達，由此調控ECM的基因表達和軟骨形成[21,22]。Tao等[23]實驗發現，滑膜間充質干細胞分泌的外泌體中Wnt5a/b含量較高，會激活YAP引起軟骨細胞的增殖和遷移，但是會引起SOX9表達降低以及ECM蛋白合成分減少。而miR-140-5p能夠通過增強SOX9以及蛋白聚糖的表達維持軟骨內細胞穩態進而緩解OA的進程，利用添加核酸的方法在滑膜間充質干細胞(synovial membrane-derived MSCs，SMMSCs)以及其外泌體中過表達miR-140-5p，能夠促進軟骨細胞的增殖和遷移的同時促進軟骨細胞合成ECM蛋白，滑膜間充質干細胞分泌的高表達miR-140-5p的外泌體具有治療OA的潛力[24]。因此，外泌體內miRNA為OA的治療提供了研究方向以及新策略。

3.抑制OA中炎性細胞外泌體對OA的治療作用：已有實驗證明在OA中關節軟骨和滑膜細胞產生的外泌體及其內容物起著促進OA發展的作用，如果抑制了相關外泌體的作用就可能緩解OA的進展。目前的研究主要集中在通過相關miRNA抑制物或者類似物(模擬物)抑制炎性細胞外泌體內miRNA及炎性細胞因子作用減緩OA，例如通過向關節腔內注射miR-34a的抑制物，增加Col2a1降低 iNOS，進而緩解OA發展過程[25]。滑膜也是目前研究可能的治療靶點之一，IL-6作為一種炎性介質在OA中起調控作用，Chen等[26]研究數據顯示，通過抑制滑膜組織外泌體中IL-6含量對于治療滑膜炎以及OA可能有著較好療效。也有部分研究者在研究干擾特定靶點的新治療方法，包括抗纖維素抗體、TNF單克隆抗體、抗神經生長因子抗體、抗蛋白酶(ADAMTs和MMPs)和緩激肽抗體等，用以對抗外泌體中相對應的成分，從而發揮治療作用。此外還可以利用外泌體進行基因治療，在關節局部導入含有高表達細胞因子基因或者細胞因子抑制劑基因的外泌體，使它們能夠緩慢且持續地在OA關節中發揮療效。

五、展望