高通量測序技術(shù)在口腔疾病中的應(yīng)用進(jìn)展

谷小杰 畢良佳

口腔作為人體“門戶”，有高度多樣性、獨(dú)特性的微生物群落，口腔微生物之間的物理、化學(xué)相互作用和口腔微生物和宿主之間的相互作用的失衡會(huì)導(dǎo)致口腔及全身疾病的發(fā)生。口腔疾病的發(fā)生常伴隨著某種特征致病微生物的比例上升，因此不僅需要全面認(rèn)識口腔微生物群落在健康和疾病狀態(tài)下的特征，還需了解某種口腔微生物的生物功能及其在群落中的作用。高通量測序技術(shù)是目前最常用的不依賴于培養(yǎng)技術(shù)的分析微生物群落組成和功能的分子生物學(xué)方法，能夠直接和全面地分析微生物的基因序列。高通量測序技術(shù)不僅能深入研究口腔微生物與口腔疾病的關(guān)系，而且從根本上改變了人們對人類健康和疾病背后的遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)分子基礎(chǔ)的理解。對患者健康和患病細(xì)胞的基因組、外顯子或轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序的見解已經(jīng)能夠改善許多口腔疾病的診斷分類、預(yù)測和治療選擇。本文就高通量測序技術(shù)平臺的發(fā)展及高通量測序技術(shù)在口腔疾病研究中的應(yīng)用進(jìn)行討論。

一、高通量測序技術(shù)

1.高通量測序技術(shù)概述：高通量測序技術(shù)又名下一代測序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)或深度測序，其特征是大規(guī)模平行測序，同時(shí)進(jìn)行數(shù)百萬到數(shù)十億個(gè)獨(dú)立測序反應(yīng)。相較于第1代測序Sanger測序技術(shù)，具有節(jié)省時(shí)間、低成本、高通量和高精確的特點(diǎn)。高通量測序可分為靶向測序、全基因組測序(whole genome sequencing，WGS)和轉(zhuǎn)錄組測序。靶向測序中包括靶向擴(kuò)增子測序和全外顯子組測序(whole exome sequencing，WES)，靶向擴(kuò)增子測序聚焦于單個(gè)或者多個(gè)目標(biāo)基因，例如鑒定細(xì)菌的16S rRNA基因、真菌的18S rRNA基因及內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)。

2.高通量測序技術(shù)平臺及應(yīng)用進(jìn)展：大部分短讀第2代測序平臺采用合成測序(sequencing by synthesis，SBS)，但不同平臺的核心技術(shù)有所區(qū)別。Roche454焦磷酸測序是最早出現(xiàn)的第2代測序系統(tǒng)，原理是酶聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，通過檢測DNA合成反應(yīng)時(shí)釋放的焦磷酸來讀取堿基信息，該技術(shù)以實(shí)現(xiàn)100倍的產(chǎn)量增加而使第1代技術(shù)發(fā)生了革命性的變化，因其成本較高，目前其配套的測序儀已停產(chǎn)。

Illumina測序是第2代測序市場的主流平臺，其核心技術(shù)為橋式PCR和可逆終止子技術(shù)。Illumina目前有4個(gè)臺式平臺和兩個(gè)大規(guī)模平臺，臺式測序儀(iSeq、MiniSeq、MiSeq和NextSeq)適用于規(guī)模較小的實(shí)驗(yàn)，例如細(xì)菌基因組分析、轉(zhuǎn)錄組分析及WES，大規(guī)模測序平臺主要適用于WES和WGS。Illumina測序的優(yōu)點(diǎn)是高輸出、高精度、低成本、應(yīng)用多樣性、跨平臺兼容性能優(yōu)以及文庫制備的多樣性。

美國Life Technologies公司推出的IonTorrent離子半導(dǎo)體測序?qū)⒑铣蓽y序與大量平行微孔陣列匹配，每個(gè)微孔陣列都有專用傳感器，將核苷酸序列直接轉(zhuǎn)換為半導(dǎo)體芯片上的數(shù)字信息。其配套測序儀IonPGM是目前市場上最便宜的測序儀，近年來推出的Ion GeneStudio S5系列測序儀改變了儀器盒和試劑，文庫制備更容易，運(yùn)行時(shí)間更短[1]。主要應(yīng)用于靶向測序、外顯子測序、轉(zhuǎn)錄組測序、小基因組測序、液體活檢及染色質(zhì)免疫沉淀測序。

第3代長讀測序平臺克服了第2代測序平臺處理復(fù)雜、無法解析重復(fù)/較大基因序列、GC偏好性等缺點(diǎn)，無需PCR擴(kuò)增，進(jìn)行超長讀長測序[2]。美國PacBio 公司開發(fā)的單分子實(shí)時(shí)測序(single molecule real-time，SMART)是第一個(gè)流行的第3代測序技術(shù)，采用邊合成邊測序的策略，技術(shù)核心是零模波導(dǎo)孔(zero mode waveguide，ZMW)。單分子實(shí)時(shí)測序省去了克隆擴(kuò)增步驟，與第2代測序技術(shù)比較，具有文庫制備時(shí)間短、運(yùn)行速度快、長讀長測序等優(yōu)點(diǎn)。隨著平臺的更新和進(jìn)步，錯(cuò)誤率已從13%降至3%。主要應(yīng)用于WGS、靶向測序、全長mRNA測序、復(fù)雜群體測序及表觀遺傳檢測。

另一個(gè)代表性的第3代測序技術(shù)是納米孔單分子測序技術(shù)(oxford nanopore technologies，ONT)。這項(xiàng)技術(shù)檢測每個(gè)堿基通過納米孔時(shí)的特征電流變化，得到堿基測序[3]。納米孔不僅可以直接進(jìn)行DNA測序，還可以直接測序RNA和蛋白質(zhì)。但是其錯(cuò)誤率極高，達(dá)15%，仍需要進(jìn)一步改進(jìn)。

二、高通量測序在口腔疾病中的應(yīng)用

1.齲病：齲病是多種微生物和飲食依賴性疾病，其特征是隨著時(shí)間的推移形成產(chǎn)酸生物膜或牙菌斑，導(dǎo)致釉質(zhì)表面脫礦，最終在臨床上出現(xiàn)齲洞的慢性破壞性疾病。在齲病病因?qū)W方面，隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，測序分析已經(jīng)鑒定出與體內(nèi)齲病發(fā)展不同階段密切相關(guān)的微生物。現(xiàn)代生態(tài)學(xué)觀點(diǎn)認(rèn)為，產(chǎn)酸和耐酸物種聚集，導(dǎo)致環(huán)境酸化，低pH值趨使口腔微生態(tài)失衡，最終導(dǎo)致齲病、牙周炎等感染性疾病的發(fā)展。Xiao等[4]應(yīng)用454焦磷酸技術(shù)對細(xì)菌16S rDNA序列V1～V3高變區(qū)擴(kuò)增測序，共對160例健康和不同程度齲病患者的齦上菌斑采樣，檢測到122個(gè)屬，453種獨(dú)立微生物。健康人群齦上菌斑的微生物多樣性高于齲病患者，隨著齲病程度加重，多樣性逐漸降低，產(chǎn)酸菌導(dǎo)致pH值逐漸下降。最近的測序分析發(fā)現(xiàn)，在未檢測到變異鏈球菌的齲病患者中，發(fā)現(xiàn)一組產(chǎn)酸和耐酸菌與齲病高度相關(guān)[5]。對晚期牙本質(zhì)齲的454焦磷酸測序結(jié)果表明，牙本質(zhì)齲中乳桿菌屬、普氏菌屬、阿托波菌屬、奧爾森菌屬、放線菌屬豐度較高，齲病進(jìn)展相關(guān)菌種在pH值梯度上選擇性聚集。高通量技術(shù)大樣本追蹤，縱向研究齲病進(jìn)程中的微生物群落組成和結(jié)構(gòu)變化，對齲病相關(guān)致齲菌有更深刻的認(rèn)識。

在齲病診斷方面，Teng等[6]追蹤研究了50例4歲兒童兩年的菌斑和唾液微生物群并進(jìn)行454焦磷酸測序，發(fā)現(xiàn)普雷沃菌是低齡兒童齲的主要預(yù)測因子，并且提出了一個(gè)齲齒的微生物指標(biāo)預(yù)測模型，作為預(yù)測未來齲齒發(fā)病的方法。在齲病治療方面，依據(jù)低pH值條件下，產(chǎn)酸菌及耐酸菌不斷作用導(dǎo)致礦物質(zhì)流失的病因?qū)W理念。Liang等[7]設(shè)計(jì)了一款添加叔胺(TA)改良的樹脂黏接劑TA@RAs，它可以響應(yīng)脫礦-再礦化的臨界pH值，通過TAs的質(zhì)子化和去質(zhì)子化作用獲得可逆的抗菌效應(yīng)。Liang等[7]又采用高通量基因測序分析顯示，TA@RAs能增加唾液生物膜的多樣性，表明新型材料有助于調(diào)節(jié)微生物群向健康穩(wěn)態(tài)方向發(fā)展。

2.牙周病：牙周病是口腔復(fù)雜微生物穩(wěn)態(tài)失衡與宿主免疫反應(yīng)相互作用的慢性炎癥性疾病，特征是牙周軟組織炎癥和硬組織喪失。高通量測序技術(shù)可以深入研究健康與不同疾病狀態(tài)下的口腔微生物群落組成和結(jié)構(gòu)，鑒定牙周相關(guān)致病菌群。對牙周病患者和健康患者齦下微生物的測序發(fā)現(xiàn)，慢性牙周炎和侵襲性牙周炎與齦下微生物的較高α多樣性和均勻度有關(guān)。在門水平上，牙周炎優(yōu)勢菌門為擬桿菌門、梭桿菌門、互養(yǎng)菌門和螺旋體門[8]。擬桿菌門、螺旋體門、互養(yǎng)菌門在廣泛性侵襲性牙周炎患者齦下菌斑中占主導(dǎo)地位[9]。Saccharibacteria(TM7)門與牙齦炎關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)[10]。在屬水平上，普氏菌屬、卟啉單胞菌屬和密螺旋體屬等是牙周炎的優(yōu)勢菌屬[11]；鏈球菌屬、嗜血桿菌屬、纖毛菌屬與牙齦炎高度相關(guān)[8]。高通量測序不僅能夠認(rèn)識微生物群落組成結(jié)構(gòu)，同時(shí)能探究微生物代謝途徑、功能基因。許多功能基因和代謝途徑在牙周病菌群中過度表達(dá)，主要參與細(xì)菌趨化、鞭毛組裝和毒素合成。有研究者應(yīng)用高通量測序技術(shù)與轉(zhuǎn)座子插入誘變技術(shù)相結(jié)合的轉(zhuǎn)座子測序技術(shù)(transposon sequencing，Tn-seq)鑒定牙齦卟啉單胞菌必須基因和毒力基因，這有助于確定特異性治療靶點(diǎn)[12]。

高通量測序技術(shù)可以動(dòng)態(tài)分析疾病發(fā)展過程中與疾病治療前后的微生物群落變化，有利于制定有效的預(yù)防和治療策略。牙周炎患者齦下菌斑微生物群落存在生物多樣性及差異，與探診深度有關(guān)。Shi等[13]比較分析健康人群、慢性牙周炎和侵襲性牙周炎不同位點(diǎn)齦下微生物組成，結(jié)果表明某些細(xì)菌與牙周袋深度呈線性相關(guān)。慢性牙周炎中支原體、產(chǎn)險(xiǎn)菌屬、消化鏈球菌等和牙周袋深度呈正相關(guān)，侵襲性牙周炎中棒狀桿菌和克雷伯菌和牙周袋深度呈正相關(guān)。楊萬娟等[14]證實(shí)牙周基礎(chǔ)治療可以改變廣泛性侵襲性牙周炎和重度慢性牙周炎患者齦下菌群的組成和結(jié)構(gòu)，降低群落多樣性，群落功能預(yù)測降低氨基酸代謝、甲烷代謝和肽酶等群落功能。

高通量測序技術(shù)可以進(jìn)行大規(guī)模基因組測序，精準(zhǔn)確定基因表達(dá)譜，鑒定牙周易感基因，鑒定和驗(yàn)證牙周診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。Kim等[15]采用深度測序法對健康人和牙周炎患者的10個(gè)牙齦組織的RNA進(jìn)行分析，共檢出牙周炎組織中400個(gè)上調(diào)基因，主要包括防御/免疫蛋白、受體、蛋白酶和信號分子基因，牙周炎62個(gè)下調(diào)的基因主要是細(xì)胞骨架蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白基因，這為牙周炎的發(fā)病機(jī)制提供了新的見解。

3.口腔鱗狀細(xì)胞癌：口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是最常見的頭頸部惡性腫瘤之一。單一病原體仍無法解釋與微生物群相關(guān)的致癌條件的復(fù)雜性，共生微生物群對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有更廣泛的影響。當(dāng)前研究結(jié)果表明，OSCC腫瘤組織內(nèi)優(yōu)勢菌屬為二氧化碳噬纖維菌屬、梭桿菌屬、卟啉單胞菌屬等[16～18]。OSCC唾液中富集菌屬多為鏈球菌屬、普氏菌屬、韋榮菌屬等[19, 20]。雖然現(xiàn)有測序結(jié)果物種組成有差異，但是都觀察到炎癥相關(guān)的微生物豐度增加，包括銅綠假單胞菌、牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌等，進(jìn)一步基因功能預(yù)測表明，與脂多糖、肽酶合成相關(guān)等促炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)顯著增加。值得注意的是，具核酸桿菌和牙齦卟啉單胞菌等牙周病病原體與OSCC高度相關(guān)，體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌具有致癌性，牙周炎已經(jīng)被視為是口腔癌的危險(xiǎn)因素。Perera等[21]應(yīng)用Illumina測序平臺揭示了一種與OSCC相關(guān)的異常真菌群，其特征是物種多樣性較低，白色念珠菌相對豐度增加。高通量測序技術(shù)描述口腔癌相關(guān)口腔微生物群特征作出了重大貢獻(xiàn)，口腔微生物群落的改變可作為預(yù)測OSCC病的診斷工具，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。Lee等[22]比較健康、上皮癌前病變、口腔鱗癌患者的唾液樣本，芽胞桿菌屬、腸球菌屬、細(xì)小球菌屬、消化鏈球菌屬和斯萊克菌屬等5個(gè)屬在上皮癌前病變組和癌癥組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可作為診斷口腔癌，尤其是上皮癌前病變-癌癥轉(zhuǎn)變的標(biāo)志物。

高通量測序技術(shù)能夠大規(guī)模、高精確快速檢測OSCC全基因組、轉(zhuǎn)錄組，研究分析OSCC基因變化，從而為OSCC發(fā)生機(jī)制的研究和早期診斷和治療提供基礎(chǔ)。Su等[23]將120個(gè)OSCC樣本進(jìn)行了全外顯子組測序，并對其中2個(gè)樣本進(jìn)行全基因組測序，揭示了反映病因和預(yù)后相關(guān)性的口腔鱗狀細(xì)胞癌分子亞群，確定了口腔鱗癌基因組編碼區(qū)突變情況。某些基因的突變可驅(qū)動(dòng)癌癥的進(jìn)展，基于高通量測序的癌癥驅(qū)動(dòng)基因突變分析有助于研究癌癥進(jìn)展過程。Al-hebshi等[24]鑒定出20個(gè)OSCC的候選新驅(qū)動(dòng)基因以及驅(qū)動(dòng)途徑，為OSCC的遺傳異質(zhì)性提供了進(jìn)一步的證據(jù)。

高通量測序可以鑒別與診斷和預(yù)后相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物，選擇合適的藥物靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)個(gè)體化治療方案，實(shí)現(xiàn)“精確醫(yī)學(xué)”。循環(huán)miRNA是診斷和評估疾病進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的理想生物學(xué)標(biāo)志物，Chang等[25]對正常、白斑和OSCC患者的血漿應(yīng)用高通量測序進(jìn)行檢測，篩選各組間表達(dá)差異的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-423-5p和miR-222-3p在口腔癌組織中顯著過表達(dá)，參與多種癌癥通路，3個(gè)miRNA(miR-222-3p、miR-150-5p和miR-423-5p)有助于監(jiān)測從口腔白斑到OSCC的惡性進(jìn)展，并作為早期發(fā)現(xiàn)口腔癌的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。Padhi等[26]篩選出104例OSCC患者，運(yùn)用高通量測序技術(shù)和比較基因組再交研究復(fù)發(fā)性O(shè)SCC和非復(fù)發(fā)性O(shè)SCC患者CDKN2A/p16的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)與非復(fù)發(fā)性腫瘤比較，復(fù)發(fā)性腫瘤中CDKN2A/p16的下調(diào)大于5倍，CDKN2A/p16表達(dá)缺失的復(fù)發(fā)病例預(yù)后差，生存率低。

4.其他口腔疾病：復(fù)發(fā)性阿弗他口炎(recurrent aphthous stomatitis，RAS)是普通人群中最常見的口腔黏膜疾病，以淺圓形潰瘍?yōu)樘卣鳌Ｓ拈T螺桿菌被認(rèn)為與RAS相關(guān)，但仍存在很多爭議。Kim等[27]使用高通量測序技術(shù)證明了RAS與口腔唾液及黏膜微生物菌群失調(diào)相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)唾液鏈球菌的減少和約氏不動(dòng)桿菌的增加與RAS風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。Yang等[28]對24例患者正常口腔黏膜和口腔潰瘍的細(xì)菌標(biāo)本進(jìn)行高通量測序分析，認(rèn)為RAS的發(fā)生與大腸桿菌和Alloprevotella的增加以及鏈球菌的減少顯著相關(guān)。

牙髓感染的治療主要是應(yīng)用根管治療對根管系統(tǒng)進(jìn)行局部消毒，消除感染源，抗菌藥物可作為控制急性感染的輔助措施。Moraes等[29]評價(jià)抗生素對急性原發(fā)性牙髓炎患者口腔環(huán)境細(xì)菌群落多樣性、結(jié)構(gòu)和代謝途徑的影響，發(fā)現(xiàn)預(yù)先使用抗生素患者的牙髓腔微生物代謝途徑發(fā)生了改變，需要進(jìn)一步研究確定先前接觸抗生素是否會(huì)引起牙髓腔細(xì)菌毒力特性的表達(dá)從而影響治療的療效。

三、展 望

在過去10年中，高通量測序的投資和運(yùn)行成本已大幅下降，高通量測序技術(shù)廣泛應(yīng)用于口腔疾病研究的各個(gè)領(lǐng)域。高通量測序技術(shù)對理解口腔疾病的分子基礎(chǔ)、常見病和罕見病的診斷以及再生療法的發(fā)展有深遠(yuǎn)的影響，對疾病的早期診斷和個(gè)性化治療提供了基礎(chǔ)，對實(shí)現(xiàn)“精確醫(yī)學(xué)”有著巨大的臨床意義，此外其作為一種明確的病原體鑒定和宏基因組分析的技術(shù)手段具有前所未有的前景。高通量測序技術(shù)平臺仍在不斷更新和發(fā)展，未來需要進(jìn)一步提高精確度、運(yùn)行時(shí)間，并降低成本，以滿足臨床應(yīng)用的需要。