蠶絲組織工程支架重建前交叉韌帶的研究進展

趙思雨 李躍中 張文元

前交叉韌帶(anterior cruciate ligament，ACL)是致密結締組織，是連接股骨和脛骨的繩狀組織，在穩定膝蓋關節和正常運動中起著重要的作用，ACL斷裂無法自愈。移植物植入骨隧道重建ACL是最具挑戰性的臨床問題之一。臨床重建ACL使用的材料包括自體移植物、異體移植物和人工合成材料，但均存在諸多問題。自體移植物供體部位發生率高，且需二次手術，并可能伴有功能障礙和不適等問題。異體移植物，存在供體缺乏和免疫排斥，且易傳播疾病和高感染率。人工合成韌帶可以有效地避免供體部位發生率和疾病傳播的風險，盡管短期效果令人滿意，但是長期隨訪結果不盡人意，可能導致更高的移植物失敗率和晚期炎性反應[1]。

目前應用于臨床的人工韌帶結構單一，韌帶在骨隧道中的愈合主要是膠原纖維與骨組織的直接結合，在結合部位由于“軟-硬”組織的直接連接缺乏力學梯度，容易造成應力集中，從而導致重建失敗。因此，在軟-硬組織之間實現功能化的組織學轉變仍是一個難題。組織工程的策略可能會突破這些限制，為韌帶修復帶來新的希望。理想的組織工程方法重建ACL主要包含韌帶再生和移植物-骨愈合兩個方面：①構建的組織工程ACL需要有足夠的力學強度，在植入與替代過程中不斷裂，不過度伸縮；②構建的移植物-骨界面止點愈合與否直接關系到移植的成敗，缺乏生物穩固性乃是移植失敗的主要原因[2]。

一、蠶絲的特性

脫膠蠶絲絲素纖維具有良好的生物及細胞相容性、獨特而非凡的力學性能，其斷裂力、彈性模量和拉伸強度與人ACL相當。其彈性模量和拉伸強度不受編織纖維數量的影響，而是受蠶絲的固有性能的影響。另一方面，斷裂力值隨著組成支架的蠶絲數量的增加而增加，只需增加或減少組成支架的纖維數量，就能使其更具仿生性[3]。蠶絲與其他生物成分結合，可增加表面面積，促進細胞黏附，提高生物相容性[4,5]。蠶絲基支架在肌腱/韌帶修復方面的體內研究，如ACL、內側副韌帶、跟腱、肩袖等，已經證實了其潛在的臨床應用前景[6]。

近年來，蠶絲憑借其出色的綜合力學性能和較慢而適當的降解時間，在眾多的ACL組織工程材料中脫穎而出，為研究者所青睞[7]。蠶絲作為一種蛋白質是可降解和吸收的，只是降解時間相對較長[8]。結合其緩慢的降解速率，由蠶絲絲素纖維蛋白制成的ACL支架在相當長的一段時間內，可以提供穩定性，允許細胞重建新韌帶組織。實現穩定屬性的逐漸轉移，即可將穩定的特性從蠶絲支架移植物轉移到新形成的組織中，而不讓病人膝關節暴露于不穩定的松弛期。因此，蠶絲絲素纖維是組織工程韌帶很有吸引力的候選材料。

二、蠶絲基組織工程前交叉韌帶的構建

目前蠶絲的構架方式主要有兩類。一類是天然蠶絲脫膠后的蠶絲絲素纖維，編織成多種形狀(如繩索狀、網狀、鞭狀等)后，具有優異的承載受力功能，可用于韌帶組織再生[9]。另一類是天然蠶絲脫膠、溶解、過濾、透析從而生成絲素溶液，并進一步加工成不同形態的再生絲素模型(如纖維狀、多孔海綿狀、膜狀等)。再生絲素纖維可以通過濕紡和微流體溶液紡制作獲得，也可用于ACL重建[10, 11]。多孔海綿狀絲素蛋白可以通過凍干、致孔等手段制備，其三維結構恰當模擬了機體生理微環境的立體結構，可提供種子細胞生長場所。

生物材料的三維結構比二維結構更接近體內的生理環境。絲素蛋白的三維結構通常以水凝膠或海綿的形式存在。水凝膠為高含水率，高孔隙率，以便為細胞遷移和擴張提供足夠的互聯網絡結構。為進一步提高支架性能，蠶絲常與其他天然高分子材料(膠原、明膠、殼聚糖和透明質酸)混合使用。大量實驗證明絲素蛋白的加入可完善支架結構，提升支架性能。如使支架生物相容性，力學性能明顯提升，孔隙分布更加均勻。體內外結果表明，殼聚糖-絲素/聚對苯二甲酸/銀@羥基磷灰石肌腱通過擴大細胞增殖和上調肌腱發育使得細胞相容性和骨整合得到了根本改善。該肌腱支架是未來ACL置換術的一個很有前途的候選者[12]。此外，混合支架可以進行物理或化學交聯，以改善參數。目前，許多合成交聯劑包括甲醛、戊二醛、甘油磷酸和雙醛淀粉等被用于生物材料的改性。

Grabska-Zielinska等[13]以絲素蛋白、膠原蛋白和殼聚糖為基質，雙醛淀粉為交聯劑，制備了三維支架材料。絲素蛋白的加入提高了支架的穩定性，同時雙醛淀粉在不影響支架的微觀結構的前提下，使支架材料的膨脹率與孔隙率得到改善，支架穩定性和孔徑規整性得到進一步提升。為滿足ACL重建需求，研究者通常將三維結構的水凝膠或海綿支架負載到編織支架上使用[14]。韌帶高級強化系統由聚對苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene glycol terephthalate, PET)制成，是目前用于ACL重建最常用的人工韌帶。但是PET是疏水的，因此很難誘導自體組織的長入。與單純PET韌帶比較，脫膠絲/PET雜化韌帶保持了更強的誘導自體組織長入的能力，說明通過絲雜化增強了PET人工韌帶與組織的結合力[15]。絲素蛋白涂層通過EDC/NHS交聯可在體內外提高PET人工韌帶的生物相容性和促進重構過程。研究表明絲素蛋白涂層能顯著改善成纖維細胞的黏附、增殖和細胞外基質分泌，并可明顯抑制炎性反應，促進新生組織再生，并在移植物內及周圍浸潤梭形細胞[16]。目前，尚未見人體臨床試驗的報道，但臨床前研究正轉向更大的動物模型[17]。

天然蠶絲絲素纖維纜索狀支架，雖然力學性能強健，但內部致密，阻礙了細胞及新生組織長入[18]。編織的鞭狀結構其空隙性得到了良好的改善。而網狀支架伸縮性和柔軟性良好，可提供足夠的內部空間供細胞及韌帶組織生長[19]。這幾種編織方式結合使用，可提高蠶絲基支架的綜合性能。

三、仿生ACL-骨界面止點的構建

正常的ACL-骨界面是一個漸進的過程，強調分層組織區域是不同的，但在結構上又是連續的[20]。每一層都表現出一個典型的細胞表型和基質組成。界面相關的細胞群在界面修復與體內平衡中扮演重要角色。從軟組織(韌帶)到硬組織(礦化骨)通過纖維軟骨過渡區，可以有效地減少骨和彈性韌帶之間的應力集中。根據天然界面的復雜性，戰略性地生物模擬對界面再生至關重要。為了重建這個多區域組織，支架界面設計必須考慮到再生多種類型的組織，有一個分層多相的支架是非常必要的。韌帶-骨結合部構建多相支架對于重建結合部具有重要的指導意義。

ACL重建術后早期韌帶張力喪失的原因多種多樣，其中移植物與骨融合緩慢被廣泛認為是主要原因。骨隧道內肌腱移植物的愈合依賴于骨與肌腱界面的骨長入或增強肌腱-骨愈合，這對減少ACL重建后的失敗率非常重要。臨床上，斷裂的韌帶需要修復到其骨附著處，但末端結構在手術修復后通常不能很好地重建，因此韌帶-骨界面整合是評價ACL重建效果的重要指標。Ran等[21]先將蠶絲膠原支架皮下植入2周，然后使支架一端游離轉移，在不中斷血液灌注的情況下重建兔ACL。重建后2周，骨和支架之間有較多的纖維結締組織產生。重建后4周和12周，形成典型的韌帶-骨界面和纖維軟骨層。支架與骨之間沒有明顯的縫隙，骨隧道內出現大量的礦化組織。

Qing等[22]制備了鋰藻土-蠶絲支架并重建兔ACL，鋰藻土的加入改善了蠶絲的力學性能，與單純蠶絲支架比較，骨隧道段周圍產生了更多的新骨組織，減小了骨隧道。另一方面，含有鋰藻土的支架可以促進纖維軟骨組織和成熟的膠原纖維的形成，促進了移植物的骨整合過程。Teuschl等[23]對綿羊行ACL切除，分別使用蠶絲支架和骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchyml stem cell, BMSCs)復合蠶絲支架重建ACL。絲質支架由于其特殊的力學性能和生物相容性，在人ACL重建中顯示出很高的潛力。ACL界面恢復效率低下被認為是常見的絲基韌帶移植物的主要障礙。Fan等[24]通過將分層方法和基因固定化相結合，開發了一種基因固定化三聯絲支架來增強ACL骨整合?；蚬潭ǖ娜嘟z支架顯著促進BMSCs的增殖和向相應細胞系分化。結果表明，采用分層方法和基因固定化有效加快了絲介導的ACL界面形成，擴大了絲基韌帶移植物用于ACL重建的治療潛力。

Font等[25]制備了雙相絲素蛋白支架，用以模擬界面膠原分子排列的梯度。支架有兩種不同的孔排列，在肌腱/韌帶側是各向異性的，在骨側是各向同性的。雙相支架支持細胞附著，能夠更好地支持功能性組織再生，允許肌腱/韌帶和骨之間的機械應力逐步轉移。PET人工韌帶的生物相容性較差，可能導致ACL重建后關節內和骨內愈合不良。通過絲素蛋白和羥基磷灰石分段涂層觀察對PET韌帶移植物結扎和骨整合過程的影響。體內研究表明，分段涂層可以提高移植物韌帶化和骨整合過程。因此，絲素蛋白和羥基磷灰石分段涂層在臨床增強ACL重建手術及移植物-骨愈合中可能有很大的應用潛力[26]。Zhi等[27]研究表明,采用種植兔BMSCs的電紡絲纖維墊包裹可促進移植軟組織的肌腱-骨愈合。

四、展 望

隨著組織工程學的不斷發展，證明蠶絲支架在保證力學性能的同時，能促進移植物愈合。BMSCs和成纖維細胞等表現出與支架的相容性，并已被證明可以增加組織膠原蛋白的產生。使用生長因子和細胞外基質衍生物可以增強這些效應。蠶絲是一種易于加工的生物聚合物，這使得以絲為基礎的生物材料被塑造成不同的形式和結構。絲蛋白作為生物材料的選擇不僅是由于其自然聚合、機械魯棒性、靈活性和廣泛的細胞相容性，還因為它可引導羥基磷灰石(骨礦物質基質的主要無機成分)增長的能力，從而改善骨整合。

蠶絲支架雖然目前在動物實驗中應用廣泛，但真正應用于臨床還有很長的路要走。未來蠶絲組織工程韌帶的發展方向，一方面可以提高和改善蠶絲性能和蠶絲支架結構，更好地與種子細胞相結合，并可與生長因子或其他材料聯合應用，以滿足臨床中ACL修復的更高需求。另一方面，可以改善手術方式，先將蠶絲支架預血管化，模擬關節外炎癥刺激，以促進血管和細胞的早期生長。另外，也可以先體外培養ACL來源的干細胞，蠶絲支架重建ACL后，行細胞關節腔內注射，以更好地促進骨-韌帶-骨再生，抑制骨關節炎。在目前可用的各種天然和合成聚合物中，蠶絲在各個醫療/制藥領域表現出了巨大的前景，這將繼續為未來組織工程、藥物輸送、生物傳感和制造技術等方面的發展做出貢獻。