腦膠質瘤的基因治療與病毒治療研究進展

張國棟，鞠海濤，黃平，岳鵬，萬方，竇長武

腦膠質瘤是一種起源于神經膠質細胞的腫瘤，占所有中樞神經系統腫瘤的40%～50%，約占所有中樞神經系統惡性腫瘤的80%，其發病率在全球范圍內持續上升[1]。雖然近年來在腦膠質瘤的治療上有了不少進展，如積極手術切除、放化療或兩者聯合治療[2]、抗血管生成治療和分子靶向治療等，但是患者的生存率仍然很低[3]，平均生存期只有14.6個月。腦膠質瘤易復發和長期生存率低的主要因素包括：(1)由于中樞神經系統內腫瘤的血-腦屏障，化療藥物的遞送困難；(2)由于中樞神經系統受系統性免疫反應的影響小，限制了系統性免疫的殺傷效力；(3)由于膠質瘤腫瘤細胞沿血管和腦白質的具有高度侵襲性彌漫性生長，難以完全手術切除腫瘤；(4)由于腫瘤干細胞細胞群對腫瘤自我更新，對化療和放療耐藥[4]。因此迫切需要研究新的治療方式。目前越來越多關于腦膠質瘤新分子治療方法的研究引起了關注，其中基因治療、溶瘤病毒療法和免疫治療在早期臨床研究中顯示出極好的前景。現對基因治療的遞送載體、膠質瘤的治療基因、常見的溶瘤病毒，以及溶瘤病毒攜帶治療基因的組合療法及其優點綜述如下。

1 膠質瘤的治療基因

膠質瘤不同類型基因治療的臨床試驗證實基因治療是安全的[5]。腦腫瘤一般局限于腦部，很少轉移到其他組織；故可以直接針對膠質瘤中分裂的腫瘤細胞(大多數腦細胞是有絲分裂后期的)進行治療，以此來抑制腫瘤的生長。膠質瘤的獨特性使其成為基因治療的目標。

1.1 條件細胞毒性基因 有條件細胞毒性基因治療的目標是將最初的非細胞毒性酶遞送到腫瘤細胞中，然后沒有毒性的前藥通過相應的酶轉化為細胞毒性代謝物。由于并非所有腫瘤細胞都能表達靶酶，因此其功效很大程度上取決于所謂的“旁觀者效應”；其中毒性代謝物能夠擴散并作用于周圍的腫瘤細胞。該療法可抑制血管生成并產生抗腫瘤作用[6]。

1.1.1 單純皰疹病毒-胸苷激酶(herpes simplex virus-thymidine kinase,HSV-TK)/更昔洛韋(ganciclovir,GCV)系統 HSV-TK/GCV系統已在臨床前和臨床上進行了廣泛的基因治療研究[7]。在該系統中，GCV不能被哺乳動物的TK磷酸化，但是病毒的TK可以使其磷酸化。HSV-TK可將GCV轉化為GCV的毒性磷酸化代謝產物，從而抑制S期細胞的DNA合成并引發細胞凋亡。雖然GCV三磷酸不能穿過細胞膜，但可以通過間隙連接分布并引起旁觀者效應。在接受HSV-TK/GCV基因治療的膠質母細胞瘤患者中也顯示出抗腫瘤免疫反應[8]；與對照組相比，接受基因治療的患者的白細胞介素(interleukin，IL)-12和干擾素-γ(interferon γ,INF-γ)水平顯著升高，這與腫瘤細胞壞死后血液中釋放的抗腫瘤抗原的免疫系統激活有關[8]。

1.1.2 CD/5-FC系統 胞嘧啶脫氨酶/5-氟胞嘧啶(cytosine deaminase/5-fluorocytosine，CD/5-FC)是另一種有前景的酶/前藥組合。當5-FC用作CD底物時，所得的5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)產物抑制胸苷酸合成酶，導致細胞死亡。由于5-FU可自由擴散到周圍的腫瘤細胞中，基于CD的基因治療能夠引起腫瘤消退伴隨強大的旁觀者效應；并且已經在大鼠神經膠質瘤模型實驗中顯示出其效果[9]。

1.1.3 其他系統 另一個系統是兔羧酸酯酶(rabbit carboxylesterase，rCE)/伊立替康系統。與人羧酸酯酶相比，rCE能更有效地將伊立替康轉化為細胞毒性藥物7-乙基-10-羥基喜樹堿；后者是一種毒性更強的物質，能強烈抑制拓撲異構酶Ⅰ[10]。此外，還有脫氧胞苷激酶(deoxycytidine kinase，dCK)/阿糖胞苷(cytarabine Arabinoside，AraC)系統，dCK可將AraC轉化為Ara-胞苷-5′-三磷酸，抑制DNA合成[11]。

1.2 靶向毒素 在一些膠質瘤亞型中，腫瘤細胞上的特異性受體的過表達為膠質瘤的靶向治療提供了極好的途徑。這些特異性受體主要包括表皮生長因子受體Ⅲ型突變體(epidermal growth factor receptor variants Ⅲ，EGFRvⅢ)抗體、IL-13Rα2、尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase type plasminogen activator，uPA)、轉鐵蛋白和其他幾種多肽。在靶向毒素方法中，靶受體的天然配體與細胞毒性細菌產物如假單胞菌(pseudomonas,PE)和白喉外毒素(diphtherotoxin,DT)的催化和易位結構域融合[12]。由于這些特異性受體在正常腦組織中幾乎不存在，因此這是一種極具吸引力的治療策略，而且其潛在的副作用很小。通過這種方式，在過表達靶向受體的腫瘤細胞中選擇性地抑制蛋白質合成，而使正常的神經細胞免于細胞毒性作用。

1.3 靶向膠質瘤的轉基因 膠質瘤基因治療的另一種策略是特異性靶向腫瘤發生，以阻止腫瘤的生長。新毛細血管的形成，是惡性腫瘤的標志性特征。其可以通過遞送抗血管生成基因或通過降低促血管生成因子的表達來靶向治療[13]。大量抗血管生成基因已被用于膠質瘤基因治療，包括編碼腦特異性血管生成抑制劑(brain specific angiogenesis inhibitors,BAI)、血管抑素、內皮抑素、血栓反應素、組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)、C-X-C基序趨化因子配體4(C-X-C motif chemokine ligand 4,CXCL4)和IL-12。編碼血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)和IL-8的促血管生成基因都是基因治療的潛在靶點。另外，通過編碼DNA修復蛋白MGMT的失活以提高烷化劑替莫唑胺(temozolomide,TMZ)的治療效果，也能達到治療膠質瘤的作用。遞送TP53腫瘤抑癌基因也被認為是一種可行的基因治療方法。

1.4 免疫調節治療基因 免疫系統是一種強有力的內源性資源，可以抗腫瘤生長[14]。活性多克隆抗腫瘤免疫應答具有長期免疫記憶的潛力，并具有清除手術后殘留的耐藥和抗原丟失的腫瘤細胞的能力。眾所周知，膠質瘤在抗腫瘤免疫治療上存在許多特有的障礙，其中包括由于中樞神經系統的血-腦屏障(blood brain barrier,BBB)和缺乏經典抗原呈遞細胞(antigen presenting cell,APC)限制了膠質瘤的免疫治療；同時，膠質瘤微環境中的免疫抑制細胞因子和細胞亞群也抵消有效的抗腫瘤免疫反應。然而，這些并非絕對的障礙，在高級別膠質瘤(high grade gliomas，HGG)中增加BBB的通透性有利于淋巴細胞浸潤。廣泛的臨床前研究證據表明，腫瘤的免疫抑制性微環境可被逆轉以產生有效的抗腫瘤免疫應答[15]。IL-2、IL-12、IL-4、IFN-γ、IHF-α、β和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)都是細胞因子途徑的免疫調節基因治療的候選者[16]。另一方面，利用表達Fms樣酪氨酸激酶3(Flt3)配體的ADV載體募集免疫細胞策略可將樹突狀細胞(dendritic cell,DC)和其他APC募集到腦腫瘤中。將此方法與提高膠質瘤抗原免疫原性的方法相結合，是產生有效抗腫瘤免疫應答的潛在策略。

2 膠質瘤溶瘤病毒治療的常見病毒

溶瘤病毒分為具有復制能力的溶瘤病毒和復制缺陷型病毒載體。其特點是病毒特異性感染腫瘤細胞并通過釋放病毒后代誘導腫瘤細胞溶解，還能激發免疫反應，吸引更多免疫細胞來繼續殺死殘余癌細胞，同時保留周圍正常的腦組織；并且已經在早期臨床試驗中證實了其安全性。

2.1 單純皰疹病毒1型(herpes simplex virus-1，HSV-1) 由于HSV-1天然的嗜神經性，首次報道經基因改造的HSV-1就是于膠質瘤溶瘤病毒研究中[17]。為了實現在腫瘤組織中保持有效的溶瘤活性，同時在正常組織中溶瘤活性最小化，已經研究了許多遺傳修飾或缺失。如ICP6(由μl39基因編碼)是非分裂細胞中DNA合成所需的病毒核糖核苷酸還原酶(ribonucleotide reductase，RNR)的大亞基，盡管其對于活躍分裂腫瘤細胞進行病毒復制不是必需的；然而μl39的缺失誘導HSV-1在活躍分裂細胞中高水平復制。另一方面，由HSV-1攜帶的34.5基因編碼的蛋白是dsRNA依賴性蛋白激酶R(protein kinase R,PKR)途徑的負調控因子，并且通過恢復真核起始因子2(eukaryotic initiation factor-2，eIF-2)(蛋白質合成中的重要因子)的活性使病毒在正常細胞中復制，否則就會被PKR所抑制。由于膠質瘤細胞中的組成型活性表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)，使γ34.5缺失的HSV-1能夠克服功能缺陷并復制，但在正常細胞中不會復制[17]。除了這些特定的遺傳修飾外，還包括其他一系列改進，如ICP47額外缺失逆轉了主要組織相容性復合物(major histocompatibility complexes,MHC)Ⅰ類分子的抗原負載活性的抑制作用，導致溶瘤性HSV-1誘導腫瘤特異性的免疫應答反應[18]。

2.2 腺病毒 最常見的腺病毒載體來自于人類腺病毒5型(human adenovirus 5,hAd5)。已知該病毒的纖維旋鈕通過識別細胞表面的柯薩奇病毒和腺病毒受體從而決定其靶細胞。然而，由于膠質瘤細胞表面缺乏上述受體從而對hAd5感染具有抗性，這就限制了hAd5病毒載體的臨床應用[17]。

溶瘤腺病毒Delta-24-RGD，是以腺病毒5型為基礎進行改造的一種溶瘤腺病毒；由于其E1A區缺失24 bp堿基，可以在RB基因突變的腫瘤細胞內復制。有研究使用病毒的Fiber部分進行RGD(arginine-glycine-aspaarticacid，RGD)修飾，修飾后的病毒可以與細胞表面的整合素 (intergrin)αvβ3和αvβ5結合并相互作用使病毒進入細胞，提高了病毒的感染性。在一項Ⅰ期臨床試驗中，一次性將這種經過改造的腺病毒(Delta-24-RGD)直接注射到25例手術和其他治療后膠質母細胞瘤復發患者的腫瘤中，結果顯示20%的患者存活了3年或更長的時間[19]。這是溶瘤病毒誘導直接溶瘤效應和抗腫瘤免疫反應的第一個臨床相關研究報道。

2.3 呼腸孤病毒 呼腸孤病毒是一類無包膜的dsRNA病毒，可通過結合大量表達的唾液酸受體和結合粘附分子(adhesion molecule，AM)有效感染大多數人類細胞，而不會引起任何嚴重的并發癥[20]。盡管呼腸孤病毒不具有細胞選擇性，但由于絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節激酶(mitogen activated protein kinase/extracellular signal regulated kinase，MAPK/ERK)信號通路通常在腫瘤中高度活化并抑制PKR功能，因此可以在包括神經膠質瘤在內的腫瘤細胞中選擇性地復制。其腫瘤細胞限制性復制能力使呼腸孤病毒成為溶瘤病毒治療中一種有希望的高效溶瘤病毒。此外，最近的研究表明呼腸孤病毒療法聯合常規分次放療(fractionated radiotherapy,FRT)和化療顯示出協同作用[21]。

2.4 麻疹病毒(measles virus,MV) 麻疹病毒是一類具有包膜的ssRNA病毒，眾所周知MV引起麻疹并且會導致腦炎[22]。MV的兩種主要蛋白在腦膠質瘤治療中具有較高溶瘤特異性。MV的趨向性是由血凝素(hemagglutinin，H)糖蛋白與宿主細胞受體(如連接蛋白-4和CD46)的親和力決定的。H糖蛋白與CD46受體有高度親和力，在膠質瘤等腫瘤細胞中大量表達；而F蛋白介導細胞與細胞的融合，誘導細胞凋亡。由于其致病性，具有癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)表達的高度減毒的麻疹病毒株-Edmonston菌株(MV-Edm)已在膠質瘤中顯示出潛在的治療效果。此外，已經開發出轉基因MV，以重新靶向HGG中的表面腫瘤特異性抗原(tumor specific antigen,TSA)；如EGFR變異體Ⅲ(EGFRV Ⅲ)或高親和力IL-13結合的跨膜蛋白IL-13受體2(IL-13R 2)[23]。

2.5 脊髓灰質炎病毒(poliovirus,PV) 脊髓灰質炎病毒是一類具有包膜的ssRNA病毒，是引起脊髓灰質炎的高度特異性人類病原體。由于其對CD155[也稱為脊髓灰質炎病毒受體(poliovirus receptor,PVR)或nectin樣分子-5(Necl-5)]的結合親和力引起的嗜神經性，已被用于治療HGG。此外，在翻譯水平上進行基因改造,即將PV基因組中的內部核糖體進入位點(IRES)序列替換為人類鼻病毒2型(human rhinovirus 2，HRV2)增強了腫瘤特異性,并使PV的致病性最小化。研究顯示該嵌合PV嚴格地復制并且在膠質瘤細胞中具有溶瘤作用，通過刪除編碼衣殼蛋白的基因改造PV復制子，使得病毒僅經歷單個裂解循環[24]。這種非致病性的病毒復制在體內外膠質瘤細胞中都顯示出了溶瘤活性。

2.6 其他病毒 新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)是一種已被證實在大多數禽類中具有高致病性的ssRNA病毒，但通常僅在人類中引起輕度喉炎和結膜炎。雖然NDV的特異性溶瘤作用已被研究證明，但其相應的機制尚不清楚。痘苗病毒(vaccinia virus，VV)是一種大型的、具有包膜的雙鏈DNA病毒[24]，其在作為天花疫苗使用中已被證明減毒VV是安全的。雖然VV主要用于基因治療和免疫治療，但有許多研究表明其具有較好的腫瘤選擇性溶瘤活性，并且在一項Ⅰ期臨床試驗中證明了其安全性[25]。

3 攜帶治療基因的溶瘤病毒的組合療法

許多學者進行了上述溶瘤病毒和治療基因的組合療法研究。與傳統病毒治療相比，其優點不僅體現在溶瘤病毒在腫瘤細胞內復制并且破壞腫瘤細胞的傳遞作用，同時也體現在病毒載體中包含的治療基因的殺傷作用。溶瘤性HSV-1攜帶治療性轉基因，如TNF-α、VEGF的短發夾RNA結構或IL-4，已用于組合性膠質瘤治療。此外，對溶瘤AdV經基因改造以表達IFN-γ、雙自殺基因CD/5-FC和HSV-TK/GCV或IL-12，在臨床前和臨床研究中均被證明有效；更重要的是，大量的證據表明使用復制缺陷型病毒載體或攜帶治療基因的溶瘤病毒治療膠質瘤沒有明顯的毒性[26]。因此，臨床可以嘗試利用多種治療特點的新病毒平臺或通過編碼病毒載體中的強效基因，通過多種不同治療效果的組合療法來提高膠質瘤的療效。

4 基因治療和病毒療法的潛在優勢

膠質瘤的基因治療和病毒療法的潛在優勢已經從多項臨床前和臨床研究的結果中得到證實[17-18,25]。首先，與常規治療方式不同，基因治療和病毒療法旨在以高度特異性的方式根除膠質瘤。遞送至腫瘤細胞的基因在異常信號傳導時被激活或發揮其特異性毒性；類似地，溶瘤病毒具有天然嗜神經性或通過遺傳修飾來影響膠質瘤細胞，但不作用于正常細胞，病毒復制及其溶瘤作用僅限于活躍的增殖細胞[25]，所有這些因素都提供了極強的治療效應。其次，有多項膠質瘤基因治療和溶瘤病毒療法研究的Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗結果顯示，基因治療和溶瘤病毒療法具有非常有效的腫瘤細胞殺傷能力和較高的安全性。雖然其臨床效果仍存在一些局限性，但通過深入研究探討一定會解決這些難題。此外，將納米顆粒引入臨床神經腫瘤治療可進一步提高基因治療和病毒療法在膠質瘤治療中的潛在作用[27]。最后，正如許多研究表明的，基因治療可能與傳統的治療方法(如手術切除及放化療)有協同作用。

5 結 論

基因治療和病毒療法可以被認為是腦膠質瘤治療方法中的新方法，而且其治療潛力才剛剛開始顯露出來。目前多項關于膠質瘤的基因治療和病毒療法的臨床研究正在進行，但是究竟哪一項能夠實現從臨床前的期望到臨床療效的飛躍仍有待觀察。相信隨著病毒基因治療研究的進展，病毒基因治療將在腦膠質瘤的治療中發揮重要作用。