化學遺傳學技術在癲癇治療中的探索與展望

晏僖，楊小楓

癲癇是腦部神經元高度同步化異常放電引起的慢性疾病。目前癲癇的患病率為1%，其中30%的患者為藥物難治性癲癇，部分藥物難治性癲癇患者可以選擇手術治療，但仍有相當部分的患者手術療效不佳或缺乏手術適應證[1]；因此，不斷出現新的治療方法[2]。近年來精準醫療已經成為現代醫學發展的趨勢。過去二十年，光遺傳學及化學遺傳學因為能夠特異性地調節神經元的興奮性，已經被引入到癲癇治療的研究之中。另外，不依賴光照裝置植入的非侵襲性的優點，使得化學遺傳學技術在臨床轉化上更具有前景[3]。化學遺傳學是一種通過改造生物大分子物質，使其能與先前無法識別的小分子化學激動劑相互作用的方法[4]。目前已成功改造的大分子包括：蛋白質激酶、代謝酶、配體門控性離子通道和G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)等[2]。基于GPCRs改造的，只由特定藥物激活的受體(designer receptors exclusively activated by designer drugs，DREADDs)技術是目前應用最廣泛的化學遺傳學技術。現對DREADDs技術的機制及其在癲癇治療中的研究現狀綜述如下，并對該技術今后的臨床轉化進行展望。

1 DREADDs技術

2007年，Roth和Armbruster等首次報道了DREADDs技術。其團隊通過對酵母的人毒蕈堿型乙酰膽堿受體M3亞型(human M3 muscarinic receptor,hM3)進行數輪隨機誘導突變并進行篩選，從而得到不能與乙酰膽堿結合的受體。但這一受體可與納摩爾濃度級別的氯氮平的氮氧化物(clozapine-N-oxide,CNO)結合。該受體具有Y3.33C和A5.46G兩個氨基酸位點突變。CNO作用于該受體后激活類似乙酰膽堿作用于M3受體的Gq信號通路，使細胞內Ca2+濃度增加，在成熟神經元中產生去極化，引起細胞興奮性增加，因此被命名為hM3Dq[5]。選擇CNO作為該突變受體的化學激動劑進行篩選，是考慮到CNO的母體化合物氯氮平具有與M3受體的高親和性、良好的血-腦屏障穿透性、藥代動力學特性，以及CNO在生理條件下的藥理學惰性。這些優點使其成為理想的DREADDs配體[6]。由于Y3.33和A5.46在不同的人毒蕈堿受體亞型中的保守性，該團隊陸續研發出一系列基于毒蕈堿受體的DREADDs家族成員(hM1Dq、hM2Di、hM3Dq、hM4Di和hM5Dq)[5]。其中hM1Dq、hM3Dq和hM5Dq可與Gq蛋白α亞單位(Gq protein α subnit，Gαq)結合，激活Gq信號通路，調動細胞內Ca2+，引起細胞興奮性增高；其中hM3Dq常作為增強神經細胞放電的有力工具[7]。hM2Di和hM4Di與Gi受體(對腺苷酸環化酶有抑制作用的受體)結合，激活Gi信號通路，引起G蛋白內向整流性鉀離子通道(G-protein inwardly rectifying potassium channels,GIRKs)開放，引起細胞超極化，減少神經細胞自發性放電活動[5]。因此hM4Di在非侵襲性的靜默神經細胞的離體或在體實驗中被廣泛使用[8]。為進一步擴展DREADDs庫，Guettier等研發了選擇性激活Gs信號通路的Gs-DREADDs，從而激活cAMP介導的信號通路，引起細胞興奮性增高。但與hM3Dq及hM4Di不同的是，Gs-DREADDs能夠在一些細胞中表現出一定的活性，這限制了該受體的廣泛使用[9]。2012年，基于β-arrestin的DREADDs技術也被報道。該受體可以在體外激活β-arrestin通路，但是該受體完全激活依賴高濃度的CNO，從而影響該受體的使用[10]。

將DREADDs轉染到特異類型的細胞上需要借助慢病毒、腺相關病毒(adeno-associated virus,AAV)或改良的單純皰疹病毒(modified herpes simplex viruses,HSVs)等病毒載體。目前最常使用的主要有三種方法：(1)借助組織特異性啟動子攜帶DREADDs基因通過病毒載體，使DREADDs表達在特定位置特異類型的細胞上[9]；(2)借助Cre-LoxP重組酶系統的特異性，通過注射攜帶DREADDs基因的FLEX開關(反向雙開放讀碼框，double-inverted open reading frame,DIO)的病毒載體轉染到Cre轉基因小鼠腦內，使DREADDs只表達在Cre表達的細胞上[11]；(3)利用改造的單純皰疹病毒的投向特異性，從而聯合使用表達Cre重組酶的逆向示蹤狂犬腺病毒(canine adenovirus,CAV)，即CAV-Cre和帶有FLEX-DREADDs的AAV(如AAV-FLEX-hM3Dq)。由于CAV的逆向投射作用，位于軸突投射區的CAV-Cre能夠逆行到轉染了FLEX-DREADDs病毒的神經元胞體，通過Cre-LoxP重組酶系統的特異性，DREADDs只表達在發出該投射的神經元細胞膜上[12]。該逆向示蹤功能使其成為神經環路研究的有力工具，使得精準調控目標腦區特定投射的神經元成為可能。

CNO是DREADDs 經典的化學激動劑，是非典型抗精神病藥物氯氮平的藥源性惰性代謝產物。許多實驗證實，CNO在推薦劑量(0.1～0.3 mg/kg)下在小鼠或大鼠體內具有惰性，并不出現藥理學和行為學的影響[13]。但有實驗表明CNO在體內可以轉化成氯氮平[14]；而氯氮平對DREADDs受體具有更強的親和力和作用效果[15]。低閾值濃度的氯氮平(0.1 mg/kg)可以產生與10 mg/kg CNO相同的作用效果[15]。氯氮平是已經被FDA批準的臨床用藥，主要用于抗精神病的治療，具有明確的藥代動力學和藥效動力學特性以及已知的不良反應，并且其選擇性激活DREADDs受體所需要的濃度非常低。Weston團隊研究發現低劑量濃度的奧氮平(一種抗精神病藥物)也可以作用于hM4Di受體[16]。這些發現使DREADDs技術的臨床轉化更具有前景。

2 DREADDs技術在癲癇治療中的研究

2005年Boyden團隊首次報道了光遺傳學技術可將光敏感性蛋白表達在特定的細胞上，利用特定波長的光線激活，從而實現對神經活動毫秒級別的精細調控[17]。化學遺傳學技術具有與光遺傳相似的細胞選擇性的調控神經元興奮性的功能，同時又比光遺傳學技術有一些明顯優勢，使之更利于臨床轉化。這些優勢為：(1)化學遺傳學技術不需要植入光纖，因此不會對腦組織造成損傷，亦不會引起光毒性；(2)由于化學遺傳學技術可以經過系統給受體激動劑，故可以對于多個致癇灶以及大面積的致癇灶進行控制；(3)相比光遺傳學技術對裝置的依賴，化學遺傳學技術使用的CNO具有生物親和性，其多種給藥途徑(如靜脈注射、口服、腹腔注射)使得DREADDs技術更加簡便可行；(4)相較于光遺傳學對神經活動毫秒級別的控制，化學遺傳學能夠產生長時程的興奮或抑制，更加有利于癲癇的治療[3]。

2014年，K?tzel等[18]首次報道了DRADDs技術可用于癲癇治療研究。該實驗采用匹魯卡品和苦味素大鼠急性皮層癲癇模型及破傷風毒素的慢性皮層癲癇模型，用載有hM4D(Gi)的AAV，通過CaMKⅡa啟動子將該受體特異性地表達在運動皮層第5層的錐體細胞上。結果顯示，1 mg/kg的CNO經腹腔注射后可以明顯降低癲癇的發作頻率和能量，緩解癲癇發作的嚴重程度。同時該實驗組使用膜片鉗技術實驗發現，將CNO作用于轉染了hM4Di的海馬腦片上能可逆性地抑制突觸興奮性神經遞質的釋放。這提示化學遺傳學技術可能會成為控制皮層癲癇發作的新方法。2016年Avaliani等報道了CNO作用于表達hM4Di的海馬腦片上可引起細胞超極化，抑制癲癇樣放電[19]。Akerman等[20]用Cre-LoxP重組酶系統的特異性離體腦片和在體癲癇模型研究表明，海馬中間神經元這一抑制系統的激活可以在原位抑制癲癇樣同步化放電。2018年，Darwin等[21]研究報道，海馬神經干細胞移植能夠減少顳葉癲癇的慢性發作；同時，用化學遺傳學技術選擇性地將分化成的中間神經元抑制后，癇樣放電增加；從而表明神經干細胞移植是治療顳葉癲癇非常有前景的方法。這些結果證明了用化學遺傳學技術通過抑制癲癇起始區的錐體神經元或激活中間神經元，可以抑制癇性放電，從而達到控制癲癇發作的效果。

Wicker等[13]使用杏仁核點燃的顳葉癲癇模型，用攜帶hM4D(Gi)基因的AAV，通過hsyn啟動子將該受體表達在丘腦中縫核群和板內核群的神經元(包括興奮性神經元和抑制性神經元)上；結果顯示CNO可以明顯抑制癲癇的腦電和行為學發作。陳忠實驗組[22]在Vgat-Cre轉基因小鼠的海馬下托(subiculum)注射載有hM3Dq的AAV，借助Cre-LoxP重組酶系統的特異性，將該受體特異性地表達在海馬下托的中間神經元上。實驗結果顯示，海人酸誘導的急性顳葉癲癇模型注射CNO后可以減輕癲癇發作的嚴重程度，延長癲癇發作的潛伏期，并減少全面性發作的次數。進一步地，該團隊利用光遺傳學和化學遺傳學技術選擇性抑制海馬下托錐體神經元的興奮性，從而逆轉了苯妥英鈉耐藥性顳葉癲癇，而將錐體神經元選擇性激活則直接誘導耐藥形成；這表明了海馬下托錐體神經元對于顳葉癲癇耐藥的形成具有重要的“門控”作用[23]。Berglind等于2018年報道了將hM4Di受體表達在對側的海馬，能夠減弱同側海馬的后放電，證明了對側海馬在顳葉癲癇進展中的重要作用[24]。Suh研究發現，用CNO特異性地作用于海馬齒狀回新生顆粒細胞的hM4Di可以明顯地降低匹魯卡品誘導的慢性顳葉癲癇的癇性放電和自發性癲癇發作；并且用CNO特異性地作用于海馬齒狀回新生顆粒細胞的hM3Dq受體，能夠顯著地增加匹魯卡品誘導的慢性顳葉癲癇的癇性放電和自發性癲癇發作[25]；表明海馬齒狀回新生的顆粒細胞對癇性環路的形成起著重要的作用，是癲癇治療的潛在靶點。以上研究結果提示化學遺傳學技術可以通過抑制癇性環路中某一靶點的興奮性，在癲癇傳播過程中控制顳葉癲癇的發作；同時表明丘腦中縫核群、海馬下托、對側海馬，以及在癲癇持續狀態后海馬齒狀回新生的顆粒細胞是有效控制顳葉癲癇發作的靶點。

綜上所述，盡管DREADDs技術在癲癇治療領域中的探索仍處于初步階段，但已有的離體組織及癲癇動物模型實驗結果表明該技術都能有效地控制癲癇活動。

3 DREADDs技術在癲癇治療的展望

3.1 癲癇起始和傳播過程中局部和遠程的調控 目前癲癇的治療可以大致分為兩種策略：(1)直接地或通過局部環路調控癲癇起始區的興奮性；(2)通過對丘腦-皮層-基底節網絡中某些靶點的遠程調控，影響癲癇在這些通路上的傳播[26]。基于同樣治療策略的腦深部刺激(deep brain stimulation,DBS)已經在臨床癲癇治療應用中有著較長的歷史[27]。

癲癇的起始和傳播與腦網絡形成的環路密切相關。如海馬-乳頭體-丘腦前核-扣帶回-海馬的Papez環路與顳葉癲癇的起始與擴散有關[28]，而皮質-丘腦-皮質環路與失神癲癇關系密切[29]。目前的研究已經證明這些環路中的海馬[30]、丘腦前核[31]，以及小腦的抑制性傳出通路浦肯野纖維[32]是癲癇治療的有效靶點。因此調節神經環路結點的興奮性對于控制癲癇的起始和傳播具有重要的作用；而發現能夠控制各種類型癲癇發作的關鍵節點，對有多個致癇灶而不能進行手術的患者，以及致癇灶位于功能區的藥物難治性癲癇患者均具有非常重要的意義。

3.2 錐體神經元和中間神經元興奮性選擇性的調節 盡管癲癇產生的機制尚不完全清楚，但是其與神經元興奮性和抑制性的不平衡是密切相關的，這一理念被普遍認可[33]。已有許多證據表明興奮性的錐體神經元與抑制性的中間神經元的相互作用對癲癇的產生具有重要意義。離體大鼠海馬腦片錐體神經元和中間神經元的同步性全細胞記錄顯示，在癲癇發生的不同時期這兩種類型的神經元激活的時間不同；中間神經元在癲癇起始時更加活躍然后出現去極化阻滯，此時錐體神經元放電增加[34]。Huberfeld等[35]研究顯示，癲癇患者的海馬組織中錐體神經元活動增加是將會出現癲癇發作，而隨著中間神經元活性增強則癲癇發作逐漸停止。而DREADDs技術能夠特異地改變不同種類神經元的興奮性，這一特點使其成為可對癲癇進行精準治療的又一新方法。DREADDs技術可以精準地調控癲癇起始區或致癇網絡重要節點特異類型細胞的興奮性。從離體組織到在體實驗，應用DREADDs技術控制不同癲癇模型(不同機制的致癇劑或腦卒中所導致的急、慢性局灶性皮層癲癇和顳葉癲癇模型)的研究結果顯示，其是一種有前景、可對癲癇進行精準調控的新型治療方法。目前DREADDs已經可以在非人靈長類動物的細胞上成功表達，能夠調節神經電生理學特性，并出現行為學改變，且未出現毒副作用[36]。因此，化學遺傳學技術在癲癇治療領域的臨床轉化有非常好的前景。

4 DREADDs技術在癲癇治療領域中面臨的挑戰

雖然DREADDs技術在癲癇治療中的實驗研究具有一定的效果，但是將DREADDs轉染到人類細胞上還需要考慮病毒載體的安全性。目前在人體的基因治療中使用AAV已有先例，且其長期的表達并未出現明顯的副作用[37]。因此，盡管還需要更加長時間的臨床觀察，但AAV是最有可能實現臨床轉化的病毒載體。與此同時，在難治性癲癇的精準治療中，其他方法的基因治療的臨床試驗，如將電壓門控性鉀離子通道—Kv1.1通過病毒轉染到腦組織，從而降低神經元的興奮性，進而治療難治性癲癇，也在進行中[38]。探測新的基因治療的安全性、耐受性的研究將為癲癇的精準治療帶來新的曙光。

綜上所述，DREADDs技術能夠持久地調節GPCRs的信號通路，并具有誘導神經調控的生理相關性、非侵襲性、可逆性等優點，在癲癇治療臨床轉化中有十分光明的前景。