黃秋葵果實正丁醇部位化學成分研究

劉桂鳳，周志強，許妍，廖爭爭

1.江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，江西 南昌 330029；2.南昌大學第一附屬醫院，江西 南昌 330004

黃秋葵Abelmoschus esculentus（L.）Moench 為原產于非洲熱帶地區的錦葵科秋葵屬一年生草本植物，又稱羊角豆等。黃秋葵以果實供食用，既是營養豐富的鮮美蔬菜，又有藥用保健效果。于20 世紀90 年代引入我國，具有利咽、通淋、下乳、調經之功效［1］。在民間，人們稱其果實為植物界的“偉哥”［2］。隨著對黃秋葵研究的深入，發現黃秋葵的花、種子、根對惡瘡及癰癤具有較好的療效。近年來，又發現其有許多新的藥理作用，例如抗疲勞、保肝護肝、提高免疫力等功效。除此之外，本課題組還發現黃秋葵的鎮靜催眠效果也較為明顯［3］。目前為止，黃秋葵中分離得到化學成分主要有不飽和脂肪酸、蛋白質、黃酮類化合物、生物堿、甾醇類以及氨基酸等多種成分。

為了研究黃秋葵的藥效物質基礎，本課題組對黃秋葵果實的正丁醇部位經AB-8 型大孔樹脂富集后的化學成分進行了分離純化，并利用其理化性質及1H-NMR、13C-NMR 等波譜技術鑒定了其中的10個化合物結構，分別為槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素、熊果酸、山柰酚、金絲桃苷、沒食子酸、香草酸、楊梅苷（myricetrin）、橙皮苷。

1 儀器與試藥

閃式提取器（河北金鼎科技有限公司），Bruker ARX-300，AV-600 型核磁共振儀（TMS 為內標，瑞士Bruker 公司），Shimadzu LC-8A 型制備型高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司）。大孔樹脂AB-8、柱層析硅膠（200～300 目）、柱層析聚酰胺（60～90 目）和薄層色譜硅膠（青島海洋化工有限公司），ODS 柱層析材料（美國Merck 公司），SephadexLH-20 凝膠（瑞典Amersham Biosciences 公司），分析純試劑（天津大茂化學試劑廠），色譜甲醇（山東禹王事業有限公司），水為超純水。

黃秋葵于2015 年8 月購自山東萊陽，經沈陽藥科大學功能食品與葡萄酒學院賈英教授鑒定為黃秋葵Abelmoschus esculentus(L.) Moench 成熟果實。

2 提取與分離

黃秋葵果實（去種子）7.5 kg，自然干燥后粉碎，以藥材10 倍量60%乙醇閃式提取3 次，每次提取30 s，合并濾液，回收溶劑，減壓干燥后得總浸膏1 321 g。加60 ℃熱水使其溶解，依次用二氯甲烷、正丁醇各萃取三次，得二氯甲烷部位（189.3 g）、正丁醇部位（380 g）。

正丁醇部位浸膏用60 ℃熱水溶解后，經大孔樹脂AB-8 處理后，依次用30%、50%、75%、100%乙醇梯度洗脫，合并相同梯度洗脫液，得30%洗脫餾分浸膏60.8 g。此部位通過聚酰胺柱色譜（60～90目）分離，用二氯甲烷-乙酸乙酯（50∶1，25∶1，4∶1，1∶10，1∶50）梯度洗脫，通過薄層檢視，合并相同餾分，得餾分Fr.1～Fr.5。Fr.1（10 g）經硅膠柱色譜（200～300 目），以二氯甲烷-甲醇（30∶1，20∶1，15∶1，10∶1，7∶1，5∶1，3∶1，1∶1）進行梯度洗脫，得到化合物1（32 mg）和化合物2（24 mg）。Fr.2（11 g）通過ODS 柱色譜，以甲醇-水（20∶80～60∶50）梯度洗脫，合并相近組分Fr.2-1～Fr.2-6，Fr.2-3（83 mg）經制備高效液相色譜，以甲醇-水（35∶65）為流動相，分離得到化合物3（23 mg）和化合物5（9 mg）。Fr.3（8.5 g）經硅膠柱色譜（200～300 目），以二氯甲烷-甲醇（15∶1，10∶1，7∶1，5∶1，3∶1，1∶1）進行梯度洗脫，合并相同組分Fr.3-1～Fr.3-4，Fr.3-2（108 mg）通過凝膠柱色譜，純甲醇洗脫，得到化合物6（19 mg）；Fr.3-3（183 mg）經ODS 柱色譜，以甲醇-水（15∶80～60∶50）梯度洗脫，合并相近組分Fr.3-3-1～Fr.3-3-3，Fr.3-3-2（55 mg）經制備高效液相色譜，以甲醇-水（26∶74）為流動相，制備得到化合物7（12 mg）。Fr.4（13 g）通過凝膠柱色譜，以甲醇洗脫，分離得到相近組分Fr.4-1～Fr.4-6，Fr.4-2（131 mg）通過凝膠柱色譜，純甲醇洗脫，分離得到化合物4（18 mg）和化合物8（51 mg）；Fr.4-4（381 mg）通過ODS 柱色譜，以甲醇-水（20∶80～60∶50）梯度洗脫，經薄層檢視，合并相近組分Fr.4-4-1～Fr.4-4-7，Fr.4-4-3（107 mg）通過凝膠柱色譜，甲醇洗脫，分離得到化合物9（25 mg）。Fr.5（3 g）通過ODS 柱色譜，以甲醇-水（20∶80～60∶50）梯度洗脫，經薄層檢視，合并相近組分Fr.5-1～Fr.5-6，Fr.5-3（81 mg）經過制備高效液相色譜，以甲醇-水（15∶85）為流動相，制備得到化合物10（29 mg）。

3 結構鑒定

化合物1：黃色粉末，HCl-Mg 粉反應、三氯化鐵試劑顯色反應均為陽性。ESI-MS（m/z）：449.2 ［M+H］+。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：12.66（1H，br s，5-OH），10.85（1H，brs，7-OH），9.72（1H，brs，4′-OH），9.38（1H，brs，3′-OH），7.31（1H，s，H-2′），7.26（1H，dd，J=8.3，2.0 Hz，H-6′），6.87（1H，d，J=8.3 Hz，H-5′），6.21（1H，d，J=2.0 Hz，H-6），6.40（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），5.27（1H，d，J=1.21 Hz，H-1″），0.83（3H，d，J=5.9Hz，H-6″）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：156.5（C-2），134.2（C-3），177.8（C-4），161.0（C-5），98.5（C-6），164.1（C-7），93.3（C-8），157.0（C-9），103.8（C-10），121.2（C-1′），115.4（C-2′），145.0（C-3′），148.2（C-4′），115.2（C-5′），120.5（C-6′），101.7（C-1″）、70.2（C-2″）、70.1（C-3″）、71.2（C-4″）、70.1（C -5″）、17.5（C -6″），以上波譜數據和理化性質與文獻報道基本一致［4］，故鑒定為槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷。

化合物2：黃色粉末，HCl-Mg 粉反應、三氯化鐵試劑顯色反應均為陽性。ESI-MS（m/z）：465.4 ［M+H］+。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：12.65（1H，brs，5-OH），10.87（1H，brs，7-OH），9.75（1H，brs，4′-OH），9.24（1H，brs，3′-OH），7.59（2H，m，H-2′,6′），6.84（1H，d，J=8.9 Hz，H-5′），6.40（1H，d，J=1.7 Hz，H-8），6.20（1H，d，J=1.7 Hz，H-6），5.47（1H，d，J=7.2 Hz，H-1′′），3.08～3.56（m，sugar protons）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：156.5（C-2），133.0（C-3），177.8（C-4），161.5（C-5），98.5（C-6），164.4（C-7），93.2（C-8），156.0（C-9），104.5（C-10），121.3（C-1′），116.0（C-2′），144.3（C-3′），148.0（C-4′），115.5（C-5′），121.7（C-6′），糖區碳信號：100.3（C-1′′）、74.4（C-2′′）、76.1（C-3′′）、69.5（C-4′′）、77.2（C -5′′）、61.3（C -6′′），以上波譜數據和理化性質與文獻報道基本一致［5］，故鑒定為槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物3：黃色粉末，HCl-Mg 粉反應、三氯化鐵試劑顯色反應均為陽性。ESI-MS（m/z）：303.2［M+H］+。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：12.48（1H，brs，5-OH），7.74（1H,s，H-2′），7.56（1H，d，J=8.09 Hz，H-6′），6.91（1H，d，J=8.12 Hz，H-5′）是一組B 環未完全裂分的ABX 耦合系統，6.41（1H，s，H-8），6.19（1H，s，H-6）是一組A 環未裂分的間位耦合的芳環系統；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：147.0（C-2），136.0（C-3），176.1（C-4），156.5（C-5），98.5（C-6），164.2（C-7），93.7（C-8），161.0（C-9），102.8（C-10），121.9（C-1′），115.4（C-2′），144.8（C-3′），147.4（C-4′），115.0（C-5′），118.5（C -6′），以上波譜數據和理化性質與文獻報道基本一致［6］，故鑒定為槲皮素。

化合物4：白色粉末狀結晶，Molish 反應呈陰性。ESI-MS（m/z）：373.8［M+H］+。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：5.12（1H，brs，H-12），4.31（1H，d，J=5.28 Hz，H-3 ），3.00（1H，m，H-3α），2.10（1H，d，J=11.28 Hz，H-18），1.31（3H，s，H-27），1.04（3H，s，H-26），0.86（3H，s，H-30），0.74（3H，s，H-23），0.67（3H，s，H-24），0.91（3H，d，J=7.95 Hz，H-29），0.81（3H，d，J=6.20 Hz，H-25）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：38.5（C-1），26.5（C-2），76.3（C-3），38.1（C-4），54.4（C-5），22.4（C-6），32.3（C-7），39.0（C-8），46.2（C-9），36.1（C-10），17.7（C-11），124.2（C-12），137.8（C-13），41.2（C-14），27.8（C-15），23.3（C-16），46.5（C-17），52.0（C-18），38.0（C-19），37.8（C-20），29.8（C-21），35.9（C-22），27.1（C-23），14.8（C-24），15.8（C-25），16.5（C-26），22.4（C-27），177.9（C-28），22.9（C-29），20.8（C-30），以上波譜數據和理化性質與文獻報道一致［7］，故鑒定為熊果酸。

化合物5：黃色粉末，HCl-Mg 粉反應、三氯化鐵試劑顯色反應均為陽性。ESI-MS（m/z）：287.2［M+H］+。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：6.19（1H，d，J=1.89 Hz，H-6），6.43（1H，d，J=1.91 Hz，H-6），6.92（2H，d，J=9.08 Hz，H-3′，5′），8.04（2H，d，J=8.84 Hz，H-2′，6′）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：146.8（C-2），135.5（C-3），175.8（C-4），160.8（C-5），98.3（C-6），163.7（C-7），93.7（C-8），156.4（C-9），103.3（C-10），121.5（C-1′），129.3（C-2′，6′），115.2（C-3′，5′），159.3（C-4′）。以上波譜數據和理化性質與文獻報道一致［8］，故鑒定為山柰酚。

化合物6：黃色粉末，HCl-Mg 粉反應、三氯化鐵試劑顯色反應均為陽性，Molish 反應呈陽性。ESI-MS（m/z）：465.4［M+H］+。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：7.52（1H，d，J=1.98 Hz，H-2′），7.67（1H，dd，J=8.14，2.10 Hz，H-6′），6.81（1H，d，J=8.52Hz，H-5′），6.40（1H，d，J=1.78Hz，H-8），6.20（1H，d，J=1.99 Hz，H-6），5.38（1H，d，J=7.72，H-1′′）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：156.3（C-2），133.7（C-3），177.3（C-4），161.5（C-5），98.6（C-6），164.3（C-7），93.6（C-8），156.5（C-9），104.4（C-10），122.0（C-1′），115.4（C-2′），144.7（C-3′），148.3（C-4′），116.2（C-5′），121.3（C-6′），101.8（C-1′′），71.2（C-2′′），73.2（C-3′′），68.0（C-4′′），75.9（C-5′′），60.2（C-6′′），以上波譜數據和理化性質與文獻報道一致［9］，故化合物6 鑒定為金絲桃苷。

化合物7：無色針狀結晶，ESI-MS（m/z）：171.2［M+H］+。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：12.25（1H，brs，-COOH），9.23（2H，brs，3，5 -OH），8.87（1H，brs，4 -OH），6.93（2H，s，H -2，6）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：120.6（C-1），108.9（C-2，6），145.5（C-3，5），138.1（C-4），167.6（C-7），以上數據與文獻報道一致［10］，故鑒定化合物7 為沒食子酸。

化合物8：淡黃色針狀結晶，三氯化鐵-鐵氰化鉀反應陽性，Molish 反應呈陰性。ESI-MS（m/z）：169.2［M+H］+。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.52（1H，brs，H-1），9.86（1H，s，H-4 ），7.42（2H,brsJ=7.8Hz，H=2，6），6.84（1H，d，J=7.8Hz，H-5），3.80（3H，s）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：56.0（-OCH3），122.0（C-1），113.3（C-2），147.9（C-3），151.3（C-4），115.3（C-5），122.0（C-6），167.7（C-7），以上波譜數據和理化性質與文獻報道一致［11］，故鑒定為香草酸。

化合物9：淡黃色片狀結晶，HCl-Mg 粉反應陽性、三氯化鐵試劑顯色反應均為陽性，Molish 反應呈陽性。ESI-MS（m/z）：465.1［M+H］+。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：12.68（1H，brs，5-OH），9.30（2H，brs，3′-OH，5′-OH），6.90（2H，s，H-2′，6′），6.37（1H，s，H-8），6.20（1H，s，H-6），5.21（1H，s，H-1′′），4.97（1H，brs，2′′-OH），4.74（1H，brs，3′′-OH），4.62（1H，brs，4′′-OH），3.99（1H，s，H-2′′），3.55（1H，d，J=8.8Hz，H-3′′），3.15（2H，m，H-4′，5′），0.84（3H，d，J=6.1Hz，H-6′′）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：156.6（C-2），134.4（C-3），178.0（C-4），161.5（C-5），98.9（C-6），164.4（C-7），93.7（C-8），157.7（C-9），104.1（C-10），119.9（C-1′），108.3（C-2′，6′），145.7（C-3′，5′），136.4（C-4′），102.3（C-1′′），70.4（C-2′′），70.9（C-3′′），71.6（C-4′′），70.5（C-5′′），17.5（C-6′′）。以上波譜數據和理化性質與文獻報道一致［12］，故鑒定為楊梅苷（myricetrin）。

化合物10：白色粉末，三氯化鐵試劑顯色反應、HCl-Mg 粉反應和Molish 反應均為陽性。ESIMS（m/z）：593.3［M+H］+。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：12.02（1H，brs，5-OH），5.50（1H，m，H-2），2.77（1H，dd，J=3.13，7.17 Hz，H-3），4.98（1H，t，J=6.8 Hz，H-1′′′），3.24（1H，m，H-3a），3.38（3H，s，4′-OCH3），1.08（3H，d，J=6.0 Hz，6′′′-CH3）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：55.7（C-CH3），78.3（C-2），42.2（C-3），197.0（C-4），163.0（C-5），96.3（C-6），165.1（C-7），95.5（C-8），162.5（C-9），100.6（C-10），130.9（C-1′），114.1（C-2′），147.9（C-3′），146.4（C-4′），112.0（C-5′），117.9（C-6′），99.4（C-1′′），73.0（C-2′′），76.2（C-3′′），70.2（C-4′′），75.5（C-5′′），66.0（C-6′′），103.3（C-1′′′），70.6（C-2′′′），72.0（C-3′′′），69.6（C-4′′′），68.3（C-5′′′），17.8（C-6′′′）。以上波譜數據和理化性質與文獻報道一致［13］，故鑒定為橙皮苷。