小麥中嘔吐毒素檢測方法的研究

□ 王 寵 賈立瑋 焦 玲 呂朝輝 郭曉姍 天水市糧油防治檢驗(yàn)中心

嘔吐毒素為鐮刀菌屬次級代謝產(chǎn)物，人體大量攝入會產(chǎn)生劇烈嘔吐反應(yīng)，引起神經(jīng)紊亂等中毒現(xiàn)象，嘔吐毒素曾在加拿大和中國引發(fā)了兩場較大的腸胃疾病風(fēng)暴[1]，其危害已逐漸被人們所認(rèn)識，我國老百姓將它污染的小麥叫做病麥或毒麥。歐盟規(guī)定未加工硬質(zhì)小麥嘔吐毒素最高限量為 1 750μg/kg[2]，我國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定小麥中嘔吐毒素不得超過1 000μg/kg[3]。因此,小麥中嘔吐毒素的檢測方法是近年來研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。本文對小麥中嘔吐毒素的4種檢測方法及其優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行闡述，即酶聯(lián)免疫篩查法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）、膠體金快速定量法、高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀法，期望檢測機(jī)構(gòu)對小麥中嘔吐毒素檢測方法選擇、準(zhǔn)確度計(jì)算以及成本估算提供依據(jù)。

1 小麥中嘔吐毒素檢測方法

1.1 酶聯(lián)免疫篩查法

稱取一定量的小麥樣品經(jīng)水提取，過濾或離心獲取上清液，與酶標(biāo)板微孔中的嘔吐毒素進(jìn)行酶聯(lián)偶合后再與試樣上清液或標(biāo)準(zhǔn)品中的競爭性微孔的預(yù)包被的特異性抗體相結(jié)合，洗滌后加入相應(yīng)的顯色劑顯色，加無機(jī)酸終止反應(yīng)后在450 nm或630 nm波長下檢測，被測物濃度與吸光度在一定范圍內(nèi)呈反比。此法為我國國家標(biāo)準(zhǔn)小麥中嘔吐毒素檢測第4法。

1.2 膠體金快速定量法

膠體金快速定量法的基本原理是免疫層析法。利用水提取樣品中的嘔吐毒素，得到的提取物質(zhì)將和帶有顏色的微粒反應(yīng)。在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)用讀數(shù)儀讀取檢測區(qū)域內(nèi)顏色的強(qiáng)度，最終換算得到檢測結(jié)果[4]。

1.3 液相色譜法

稱取25 g粉碎后的小麥樣品于250 mL具塞三角瓶中，加入5 g聚乙二醇和100 mL水混合均勻，提取 20 min過濾后通過免疫親和柱凈化，用高效液相色譜-紫外檢測器測定，外標(biāo)法定量評估。此方法為我國國家標(biāo)準(zhǔn)小麥中嘔吐毒素檢測第二法。

1.4 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀法

稱取5 g樣品于50 mL離心管中，加入20 mL提取液提取30 min，取 0.5 mL離心后的上清液與水1∶1稀釋混合均勻，過濾上機(jī)檢測[5]。此法已作為糧食行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)且在糧油檢測中廣泛應(yīng)用。

2 小麥中嘔吐毒素檢測的4種方法優(yōu)缺點(diǎn)

2.1 酶聯(lián)免疫篩查法

優(yōu)點(diǎn)：樣品不需要凈化；檢驗(yàn)程序簡單且速度較快；提取液為水，成本較低；酶標(biāo)檢測儀購置價(jià)格較低，一般檢測機(jī)構(gòu)可接受[6]。ELISA法回收率在75%～125%，檢出限為 200 μg/kg，定量限為250 μg/kg。針對大量小麥樣品快速篩選時(shí)，此方法易操作、靈敏度高、等待結(jié)果的時(shí)間短，適用性更強(qiáng)。

缺點(diǎn)：每一批次檢測操作人員必須直接接觸高濃度嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品（最高濃度可達(dá)2 000 μg/kg），這對檢驗(yàn)人員的專業(yè)水平及實(shí)驗(yàn)操作環(huán)境要求較高。目前市售試劑盒有48孔及96孔，批量檢測需消耗10～12個(gè)微孔做標(biāo)準(zhǔn)曲線，其余84～86個(gè)微孔可用來檢測樣品，雖然批量檢測成本低，但單個(gè)樣品的檢測也需占用微孔做標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此試劑盒消耗較大，成本較高。

2.2 膠體金快速定量法

優(yōu)點(diǎn)：與其他檢測方法相比，膠體金快速定量法速度更快、對檢測人員的專業(yè)化水平要求相對較低、檢測結(jié)果的精準(zhǔn)度也為人們所接受、檢測儀器能夠直接攜帶到小麥?zhǔn)召彫F(xiàn)場。檢測過程中檢測人員不需直接接觸嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品，對人員及實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求相對較低。李培真[7]等用膠體金測試條快速定量法檢測糧食中嘔吐毒素時(shí)，從樣品處理到讀數(shù)，15 min即可完成一個(gè)樣品的測定。因此膠體金快速定量檢測法在收購小麥的實(shí)際操作過程中,更受工作人員的青睞。

缺點(diǎn)：朱云等[8]在研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)嘔吐毒素濃度小于1 500 μg/kg時(shí)，膠體金檢測技術(shù)與液相色譜法有良好的線性關(guān)系，當(dāng)濃度增大時(shí)，兩種方法的檢測結(jié)果相差較大。

2.3 高效液相色譜法

優(yōu)點(diǎn)：我國國家標(biāo)準(zhǔn)中高效液相色譜法的檢出限為100 μg/kg,定量限 為200 μg/kg[9]。王 俊 雙[10]利 用HPLC法經(jīng)同一樣本多次重復(fù)測定，檢測相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.53%，因此HPLC法對嘔吐毒素的檢測精密度較高，回收率在70%～90%。研究表明，HPLC法測定小麥中嘔吐毒素含量的不確定度為71 μg/kg[11]。針對少量小麥樣品質(zhì)量的高精度檢測時(shí)，選擇HPLC法更為適宜，其檢測結(jié)果誤差較小。必要情況下，聯(lián)合應(yīng)用ELISA法和HPLC法，既能彌補(bǔ)單一檢測方法的不足之處，又能得出準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。

缺點(diǎn)：HPLC法檢測步驟煩瑣；提取所用的有機(jī)試劑及凈化所用的免疫親和柱成本高；經(jīng)過免疫親和柱處理得到的檢測結(jié)果時(shí)間較長；受不同廠家免疫親和柱柱容量影響，檢測高濃度樣本時(shí)需要增加稀釋倍數(shù)，這對操作人員的專業(yè)水平要求較高；HPLC法上機(jī)檢測前的氮吹環(huán)節(jié)對實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)更高。

2.4 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀法

優(yōu)點(diǎn)：前處理操作簡單，耗時(shí)較少且一次可同時(shí)檢測多種真菌毒素，靈敏度較高，選擇性強(qiáng)，其檢出限 為0.3～60.0 μg/kg,定量限 為1.0～200.0 μg/kg。

缺點(diǎn)：液質(zhì)聯(lián)用儀購置價(jià)格昂貴，一般配置價(jià)格需要100萬元以上，較高配置可達(dá)200萬～300萬；穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)價(jià)格較高，對檢測機(jī)構(gòu)的成本壓力較大，大多基層實(shí)驗(yàn)室無法實(shí)現(xiàn)。

3 結(jié)語

近年來，基于小麥中嘔吐毒素檢測的研究方法較多，但是操作簡單的檢測方法在靈敏度、準(zhǔn)確度上還有一定的差距。準(zhǔn)確度較高的方法操作過程復(fù)雜，需要的儀器設(shè)備價(jià)格較高，在基層實(shí)驗(yàn)室無法全面普及。

小麥在田間和儲藏過程中會受到不同種類真菌的污染，產(chǎn)生的真菌毒素種類較多，常見的有嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素等，因此，小麥在自然情況下可能含有多種真菌毒素，需要使用幾種檢測方法進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)才能得到不同真菌毒素的含量。目前，急需研究一種能同時(shí)檢測小麥中多種真菌毒素的檢測方法，以便能夠?qū)崿F(xiàn)小麥中多組份真菌毒素地快速篩查、準(zhǔn)確定性和精準(zhǔn)定量檢測，提高檢驗(yàn)檢測效率，降低檢驗(yàn)檢測成本，為基層實(shí)驗(yàn)室以及小麥?zhǔn)斋@、入庫等環(huán)節(jié)提供快速、準(zhǔn)確檢測結(jié)果的方法，便于在實(shí)際操作中推廣。