探討多重PCR技術在食品檢測中的應用與展望

□ 閆倩倩 秦皇島市食品藥品檢驗中心

多 重PCR技 術 于1988年 被Chamberlain等研究人員提出，經過多年的發展，在病原體檢測、遺傳病檢測等醫學領域，以及食品病原微生物檢測、食品原料溯源等食品領域取得了較大的發展。本文主要從食品安全檢測方面來探討多重PCR技術的應用途徑及其具體的展望，目的是進一步探索其利用空間，推動其更為廣泛的應用，以此來保障當前市場上的食品安全。

1 多重PCR技術概述

多重PCR技術又稱復合PCR技術、多重引物PCR，是在常規PCR技術的基礎上進行不斷改進，形成的一種應用范圍更廣、更加有效的PCR新技術。一般情況下PCR技術會選擇單一引物來實現擴增，但是多重PCR技術會在本身體系結構中增添更多的引物來進行擴增，目標片段之間有著較大的差異性，因此在經過多重PCR技術擴增后，凝膠成像能直接進行分析，與常規PCR技術相比，多重PCR技術可節約成本、時間以及模 板DNA。

多重PCR技術以常規PCR技術為基礎，利用脫氧核糖核苷酸、多對引物、模板DNA，并依靠DNA聚合酶進行促合成反應，其表現出一定的高效性、系統性、經濟簡便性。在高效性方面，在同一階段、同一體系中能夠利用該項技術檢測多種形式的病原菌以及目標基因等；在系統性方面，該項技術可同時檢測同一癥狀不同形式的病原菌，提升檢測效率；在經濟性方面，同一體系能夠完成多種形式的反應，較大程度地縮短了檢測時間、節省了檢測材料[1]。

2 多重PCR技術在食品檢測中的應用

2.1 單一病原細菌檢測

2.1.1 沙門菌檢測

沙門菌血清型復雜，應用常規PCR檢測會出現假陽性，其本身特異性較差，因此有較大的局限性。多重PCR技術可選擇沙門菌中數個相對保守的基因序列，以引物來實現自身的擴增，以此來凸顯自身的特異性特征，并降低假陽性的出現。沙門菌能導致人體出現傷寒、敗血癥等疾病，在設計其具體的引物基因時可從血清型與血清群兩種形式的特異性基因著手。部分學生在綜合分析了各種類型沙門菌具體類型后，對其進行了專項引物設計，然后依次為基礎應用多重PCR技術進行對應的檢測工作，發現可特異性檢出腸炎沙門菌的敏感度達到了95%，遠高于一般細菌學檢測的92.5%

2.1.2 副溶血性弧菌檢測

副溶血性弧菌較為常見，主要存在于近海貝類、魚類等海產品中，會引發心臟病、反應性關節炎、食物中毒等病癥。Bej等結合相對耐熱直接溶血素的crh基因、耐熱直接溶血素的tdh基因以及副溶血性弧菌編碼不耐熱溶血素的dh基因進行了引物設計，緊接著應用多重PCR檢測樣品中包含的副溶血性弧菌，發現其特異性強、敏感性高，能夠很好地進行毒株與非產毒株區分，相比于傳統形式的病菌測試有著較大的優勢[2]。

2.2 多重PCR檢測

2.2.1 多重PCR檢測多種病原菌

在一根PCR反應管中，同一階段在反應管中加入各種病原菌引物，通過種方式進行PCR擴增，能對其中存在的病原細菌進行多方面的檢測，從而發掘其中存在的各種形式的病原細菌。目前很多病原菌只需少量即可對人體造成較大的威脅，1 cfu至10 cfu的菌體細胞已能夠致命。Ramesh等對現行的DNA提取方式進行了改良，選擇多重PCR進行牛奶中小腸結腸炎耶爾森氏菌與金黃色葡萄球菌的檢測，且不需要再進行增菌檢測，敏感性為104cfu/mL，但需雜交鑒定PCR產物。但是以上方法在一些層面仍舊難以滿足食品樣品檢測在敏感性方面的要求，因此需對食品樣品目標菌實施增菌 培養[3]。

一般情況下，一種病原細菌對應一種類型的增菌培養基，因此應用多重PCR進行檢測時就需含有多種病原細菌的培養基來支持，提升檢測效率的同時降低成本。應用較多的非選擇性增菌培養基包括：蛋白緩沖水、胰酶大豆肉湯、營養肉湯等，當前研究階段能同時集聚各種類型病原細菌的培養基不多，其中應用較為普遍的是預增菌肉湯，其具備單核增生李斯特菌、大腸桿菌、沙門菌等多種原細菌。Kawasaki S等借助多重PCR同一時間點檢測肉類中包含的大腸桿菌、李斯特菌、沙門菌，應用預增菌肉湯，并進行增菌，能使之達到1 cfu/25g的檢測敏感性[4]。

2.2.2 真偽鑒別檢測

對食品真偽進行鑒別很有必要，特別對肉類加工食品進行鑒別可避免無良廠商以次充好，應用多重PCR技術對動植物源性、肉類摻假的成分進行檢測，能取得較好的檢測效果。在鑒定肉類食品成分時，通常會選 擇 位 于mtDNA上 的165rDNA、12SrDNA、細胞色素b基因等，對各種形式的物種而選擇對應的特異性引物，鑒定不同種類肉類成分的加工食 品。Yin等 以12SrDNA為基礎進行了三對引物的設計，使得在檢測耗牛肉與普通牛肉的二元混合物時檢出限達0.1%。而Soares等通過多重PCR技術實現了家禽、反芻動物、豬等肉類食品的檢測。而蘇葳藝等則是對牛肉樣品中的鼠肉、雞肉、豬肉成分等進行了多重PCR擴增，檢出限 達1%。

3 多重PCR技術應用展望

多重PCR技術，突出快速高效以及節約成本的特點，可進行多種目標片段的同時檢測，并且在未來會實現與其他方式結合應用，比如AFLP多重、多重逆轉錄、熒光定量多重等方面的PCR技術，可廣泛應用于食品檢測的各個方面。此外，還會集中在以下3個方面：①引物對數會基于各方面的需求而不斷增加、擴增效率此時也會同步提高；②反應條件在各種應用環境下會得以優化，擴增效率在不斷提升的同時，檢出限出現降低趨勢；③與其他形式的分子生物學技術能夠進行結合使用，檢測特異性、靈敏度以及范圍得以提高[5]。

4 結語

綜上所述，本文對多重PCR技術在食品檢測中的應用與展望進行了探討與論述，可觀察出該項技術相比于一般PCR技術的優勢所在。因此需給予多重PCR技術足夠的重視，探索其更多的發展空間與發展潛力，使其能夠在最優環境下實現充分的利用，從而高效率、高質量地完成系列檢測任務，并較大程度的降低檢測 成本。