乳酸菌發酵生產D-/L-乳酸的研究進展

劉金熙，李冠洋，金 清

（延邊大學 農學院，吉林延吉 133002)

乳酸，學名α-羥基丙酸或2-羥基丙酸，是自然界中最小的手性分子。由于乳酸分子內含有一個不對稱的碳原子，因此按其旋光性可分為D（-）-乳酸，L（+）-乳酸。合成L-乳酸的乳酸菌大致分布在乳桿菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬和片球菌屬中的40余種[1-2]。合成光學純D-乳酸的乳酸菌主要分布在乳桿菌屬[1,3]、芽孢桿菌屬、明串珠菌屬和芽孢乳桿菌屬4個屬[4-5]。乳酸是世界三大有機酸之一，被美國食品和藥品管理局認定為“公認安全物質”，廣泛應用于食品、醫藥和化妝品等領域[6]。乳酸制備方法中，與化學合成法相比，微生物發酵法生產得到的乳酸因純度更高而備受青睞。具備優良發酵特性的菌種是微生物發酵法工業化的核心。本文對基因工程發酵生產D-/L-乳酸優良菌種的研究進展進行綜述。

1 乳酸的制備方法

目前，應用于工業化生產乳酸的方法主要有兩種，分別是化學合成法和微生物發酵法[7-8]。化學合成方法制備乳酸有乳腈法、丙烯腈法、丙酸法、丙烯法等。通過化學合成法生成的乳酸一般需要進行化學手段拆分，實現難度大、成本高，且過程中產生的毒性對人與環境均造成較大威脅，因此一些地區禁止應用此類方法進行乳酸的工業合成[9-10]。微生物發酵法是在以葡萄糖、蔗糖、淀粉等糖類作為發酵碳源的培養基中接入微生物，如乳酸菌等發酵生產乳酸的方式進行生產[11]。根據發酵途徑不同，一般分為同型乳酸發酵、異形乳酸發酵和雙歧發酵。與化學合成法相比，微生物發酵法生產得到的乳酸純度較高，生產出來的聚乳酸的商業價值也更高，從而被廣泛應用。

2 優良菌種篩選與改造

優良菌種是發酵產業的的核心，也是乳酸工業化生產保障。自然篩選作為一種菌種選育的手段，對工業中微生物育種有很大的作用。吳錦蘭等[12]以柳州傳統發酵酸筍為原料，分離并篩選得到一株高產乳酸的乳酸菌菌株LB-1-23，并鑒定其為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。在優化條件下，乳酸產量為12.74 g/L。宮路路等[13]從云南傳統發酵豆豉中分離并篩選得到一株高產乳酸的植物乳桿菌，并對其產酸培養基組成及條件進行優化，將之命名為Lactobacillus plantarumYM-4-3。吳錦蘭等、宮路路等均通過自然選育的手段篩選得到高產乳酸的植物乳桿菌，但該方法的缺點是菌株自然突變的概率較小，比較難篩選得到理想的菌株。通過傳統的物理、化學的方法進行誘變得到所需菌株的方法也比較常見，王云曉[14]、劉聯杰[15]均對出發菌株進行紫外誘變與硫酸二乙酯（DES）誘變，得到生成相應手性乳酸的目標菌株。雖然所得菌株突變率高，但需要對突變菌株進行遺傳穩定性試驗，工作量繁重。目前，分子生物學技術在乳酸合成領域的應用受到廣泛關注。通過利用基因工程技術的方法育種可以克服上述兩種方法的缺點，對菌株進行定向改造并穩定遺傳，所得菌株可以進行高純度的D-乳酸或L-乳酸合成。

乳酸脫氫酶（Lactate Hehydrogenase，LDH）是乳酸菌生成乳酸代謝途徑中催化丙酮酸轉化成乳酸的關鍵酶，其立體定向性決定了乳酸的構型。根據催化產物不同，乳酸脫氫酶分為D-乳酸脫氫酶和L-乳酸脫氫酶兩種，分別產生D-乳酸和L-乳酸[16-17]。乳酸的合成構型由D,L-乳酸脫氫酶基因的表達水平決定，所以當下國內外的研究重點主要集中在乳酸菌的D,L-乳酸脫氫酶的編碼基因上[18]。

KONG等[19]通過基因修飾并敲除推測的D-乳酸脫氫酶基因構建了高效產L-乳酸的馬仙克魯維酵母菌株。經同步糖化、共同發酵，該菌株在42 ℃下從玉米芯渣中產L-乳酸103.00 g/L，光學純度99.5%。OKINO等[20]利用基因工程手段敲除谷氨酸棒桿菌L-乳酸脫氫酶基因，再轉入大腸埃希菌D-乳酸脫氫酶基因，所得菌株發酵生產D-乳酸的量達到120 g/L，光學純度高于99.9%。張媛等[21]對篩選得到的一株耐高溫耐高糖的植物乳桿菌使用同源重組的基因工程手段，進一步提高其活性，得到基因工程菌Lp-DA。該菌株45 ℃發酵產乳酸近200 g/L，D-乳酸光學純度達到99.9%。生長迅速，營養需求簡單，發酵周期短的大腸桿菌在代謝工程育種中，具有遺傳背景清楚、易于進行遺傳操作等顯著優勢[22]。趙錦芳等[23]構建產L-乳酸大腸桿菌基因工程菌，在15 L發酵罐中以6%的葡萄糖為碳源進行發酵，乳酸生產強度為1.14 g/（L·h），乳酸的產量達到41.13 g/L。L-乳酸純度達95.69%。TIAN[24]通過CRISPR-Cas9基因編輯平臺開發了一株高光純度L-乳酸生產菌株。利用自適應進化技術，選育出在高溫45 ℃下能高效產L-乳酸的高效菌株NCBIO01-M2-ldhL1-HT。該菌株在高初始葡萄糖濃度下進行開放發酵，可產生221.0 g/L的L-乳酸。發酵液中L-乳酸光學純度達99.1%以上，L-乳酸產率達7.5 g/L/h以上，產率達0.96 g/g以上。魯泓鷹[25]采用RED基因置換技術將ldh L基因置換為ldh A基因，對產D-乳酸的大腸桿菌工程菌株進一步厭氧生長篩選，得到一株厭氧條件生長良好的菌株LHY02。在單因素實驗的基礎上，在最優發酵條件下發酵，得到D-乳酸產量為（38.18±1.85）g/L。周麗[26]在關于基因刪除對大腸桿菌乳酸代謝影響進行了系統地研究，將野生型大腸桿菌中的8個基因進行了選擇性地組合刪除，得到重組菌株B0013-070，D-乳酸產量可達125 g/L，光學純度大于99.9%。

3 結語

菌種性能優劣直接關系到發酵工業的成敗，野生型菌株一般要進行育種后才能達到工業要求進行發酵生產。隨著D-/L-乳酸在生活中的需求日益擴大，以單一酶促反應為出發點的菌種改造應用在工業生產仍有局限。未來應以酶促反應之間的協同作用為突破點，充分利用現有的研究資料與現代科學，開展對D-/L-乳酸發酵生產菌的代謝網絡分析和育種，從而進一步契合工業生產的要求。