GC-MS方法測(cè)定大蒜素/β-環(huán)糊精包合物中DATs含量

＊張麗娜 楊柒華 卓小月 周俊 楊志勇*

（1.大理大學(xué)藥學(xué)院 云南 671000 2.大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院 云南 671000）

1.前言

烯丙基三硫醚（DATs）為大蒜素的主要活性成分，其分子性質(zhì)活潑、易于揮發(fā)，有令人不快的臭味。制藥和食品工業(yè)中常用環(huán)糊精將DATs分子包合，可以掩蔽其刺激性臭味，提高DATs在儲(chǔ)藏過(guò)程中的穩(wěn)定性。然而，由于DATs與β-環(huán)糊精間的絡(luò)合效應(yīng)[1-2]，對(duì)包合物中DATs定量測(cè)定卻是一個(gè)難題。傳統(tǒng)的定硫法、硝酸汞滴定法等在滴定過(guò)程中由于環(huán)糊精對(duì)滴定劑的吸附而無(wú)法使用；分光光度法檢測(cè)217nm處吸收峰，無(wú)法對(duì)包合物中的DATs進(jìn)行選擇性定量[3]；色譜法是DATs分析的主流技術(shù)，尤其氣相色譜法非常適合測(cè)定揮發(fā)性DATs，但要求將DATs自包合物中游離后方可測(cè)定[4-5]。現(xiàn)有的前處理方法對(duì)包合物樣品的提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，且使用的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)與DATs分子結(jié)構(gòu)差異大，難以正確反映DATs與環(huán)糊精之間萃取過(guò)程中的損耗比率[6-8]。此外，DATs產(chǎn)品中包含烯丙基二硫醚等活性成分以及大量類似結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)成分，對(duì)DATs測(cè)定造成干擾。本實(shí)驗(yàn)在前人工作基礎(chǔ)上，發(fā)展一種超聲條件下溶劑萃取包合樣品中DATs，通過(guò)GC-MS定量檢測(cè)DATs含量的方法，為推進(jìn)DATs包合物產(chǎn)品的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

2.實(shí)驗(yàn)部分

(1)實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

JBT/C-YCL型超聲波藥品處理機(jī)（濟(jì)寧金百特電子有限公司）；

Sartorius普及型pH計(jì)DB-10（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；

安捷倫7890A氣相色譜配5975C型質(zhì)譜檢測(cè)器（Agilent Technologies，美國(guó)），色譜柱Agilent DB-WAX內(nèi)徑0.25mm 長(zhǎng)30mm（Agilent Technologies，美國(guó)）；

KQ5200DB型超聲清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；

CP224C型電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司）；

HYQ-3110型渦旋混勻器等；

DATs標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)ChromaDex公司；DATs標(biāo)準(zhǔn)品采用DATs注射液（江蘇徐州萊恩藥業(yè)有限公司，批號(hào)： 1303161）；

β-CD環(huán)糊精（藥用級(jí)，西安悅來(lái)醫(yī)藥科技有限公司）， 95%乙醇（AR，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司），無(wú)水乙醇（AR，汕頭市達(dá)豪精細(xì)化學(xué)品有限公司），丙酮（AR，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司），乙酸乙酯（AR，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司）其他試劑無(wú)特別說(shuō)明均為分析純。

(2)實(shí)驗(yàn)方法

①工作曲線的制備

取DATs標(biāo)準(zhǔn)品加丙酮稀釋成1.5mg/mL的儲(chǔ)備液，以丙酮按15μg/mL、7.5μg/mL、1.5μg/mL、0.3μg/mL、0.1μg/mL、 0.05μg/mL稀釋成一系列的濃度，定容10mL。混勻后取1μL注入GC-MS，以DATs峰面積對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度進(jìn)行回歸計(jì)算，得到濃度標(biāo)準(zhǔn)方程：

在0.05～15μg/mL范圍內(nèi)色譜峰面積（A）與DATs濃度（C）線性關(guān)系良好。

②β-環(huán)糊精包合物的制備

將新鮮大蒜去皮，稱取20g，切成＜1mm薄片，按照均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)方案條件加入溶劑，用NaOH或鹽酸調(diào)節(jié)pH，放入預(yù)先設(shè)置好頻率、溫度的超聲波樣品處理機(jī)提取-包合，達(dá)到預(yù)定時(shí)間后抽濾，固體樣品室溫下真空抽干，密閉保存待測(cè)。

③DATs包合物樣品前處理

精確稱取包合物固體樣品0.1g，準(zhǔn)確加入3mL丙酮，封口膜密封后，重復(fù)提取兩次，每次0.5h，合并濾液，以0.22μm尼龍針頭濾器過(guò)濾，取1μL樣品注入GC-MS，測(cè)定結(jié)果。

④DATs含量的GC-MS分析

DATs樣品采用Agilent5957 GC-7890C MS氣質(zhì)聯(lián)用儀分析，色譜柱為DB-WAX（30m×0.25mm），進(jìn)樣量1μL，分流比5:1。進(jìn)樣口溫度250℃，程序升溫條件：柱溫50℃，保持1min，按20℃/min升溫至160℃，保持5min。載氣為純氦氣，流量為2mL/min，MSD傳輸線溫度保持250℃。

質(zhì)譜采集條件：溶劑延遲3min，離子源溫度為230℃，四極桿溫度為150℃，選擇離子監(jiān)測(cè)模式。

⑤包合物樣品中DATs的含量

萃取液中DATs含量按下式計(jì)算：

包合物樣品中DATs的含量按下式計(jì)算：

3.結(jié)果與討論

(1)GC-MS分析方法的建立

二烯丙基三硫醚（DATs）是大蒜的主要活性分子，極易揮發(fā)，非常適合用GC-MS進(jìn)行定量分析。使用DB-WAX色譜柱，在選定的色譜條件下，DATs標(biāo)準(zhǔn)品、DATs注射液均在tR=8.65min出峰，峰形對(duì)稱，與其他雜質(zhì)完全分離(圖1)。圖2為其對(duì)應(yīng)質(zhì)譜圖。m/z 178為二烯丙基三硫醚的分子離子峰，其余各峰為DATs的特征碎片離子峰。

圖1 DATs（二烯丙基三硫醚，DATs）標(biāo)準(zhǔn)品的TIC圖

圖2 DATs的質(zhì)譜圖

經(jīng)NIST標(biāo)準(zhǔn)圖譜檢索，確證其結(jié)構(gòu)為二烯丙基三硫醚。

①DATs在不同溶劑中的色譜行為

實(shí)驗(yàn)使用DATs標(biāo)準(zhǔn)品（純度為≥98%）與大蒜素注射液樣品進(jìn)行了不同溶劑中色譜行為的對(duì)照研究，圖1為二者的乙醇溶液總離子流色譜圖。由圖可見(jiàn)，二烯丙基三硫醚均在8.65min出峰。對(duì)大蒜素注射液以乙醇進(jìn)一步稀釋后發(fā)現(xiàn)在DATs峰形對(duì)稱，附近的雜質(zhì)峰干擾較少，在其他有機(jī)溶劑中的色譜行為完全一致。

為研究方法的分析靈敏度與專屬性，根據(jù)文獻(xiàn)采用乙醇、丙酮、正己烷和乙酸乙酯4種溶劑對(duì)DATs標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋，并在相同色譜-質(zhì)譜條件下進(jìn)樣分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DATs乙醇溶液的濃度為500ng/mL烯丙基三硫醚峰完全消失，而在高濃度范圍（1.5μg/mL～150μg/mL）峰面積與濃度呈線性關(guān)系，整體表現(xiàn)出較低的檢測(cè)靈敏度；DATs正己烷溶液稀釋至300ng/mL以下，出現(xiàn)雜質(zhì)峰使主峰嚴(yán)重變形，保留時(shí)間發(fā)生遷移而難于定性。

大蒜素注射液樣品的研究結(jié)果與DATs標(biāo)準(zhǔn)品一致，樣品中一定量的雜質(zhì)在極低濃度下對(duì)DATs出峰形成干擾，（如DATs峰在原位置完全消失，而相鄰峰經(jīng)NIST庫(kù)檢索為二烯丙基三硫醚，但該峰面積在DATs濃度為300ng/mL～10ng/mL范圍不隨濃度變化）。因此，在極稀濃度下DATs峰定性，應(yīng)采用保留時(shí)間和NIST庫(kù)檢索對(duì)照定性為宜。

DATs標(biāo)準(zhǔn)品、注射液樣品色譜行為比較表明，在丙酮中DATs稀釋所得雜質(zhì)峰較在正己烷中明顯少，作為常用的GC樣品溶劑，丙酮在萃取DATs時(shí)可能比正己烷更有選擇性，這十分有利于對(duì)DATs在低濃度下的定性。

②萃取溶劑的篩選

實(shí)驗(yàn)考察了DATs在無(wú)水乙醇、正己烷、乙酸乙酯、丙酮四種溶劑中的響應(yīng)信號(hào)。結(jié)果顯示，在2.2.4實(shí)驗(yàn)條件下，DATs溶于乙酸乙酯中的樣品峰面積最低，其次按正己烷，乙醇，丙酮順序遞增。DATs丙酮溶液峰面積在兩個(gè)樣品濃度（1.5μg/mL，7.5μg/mL）均顯著高于其他溶劑形成的DATs樣品峰面積，表明DATs在丙酮中的溶解度最好，萃取效率最高（圖3）。過(guò)去文獻(xiàn)報(bào)道采用丙酮、乙醇作為DATs萃取常用的有機(jī)溶劑，而在本實(shí)驗(yàn)條件下，乙醇對(duì)DATs的溶解性遠(yuǎn)不如丙酮，這可能是由于其為質(zhì)子化溶劑，與非質(zhì)子化極性溶劑丙酮在溶劑化機(jī)制上的差異，造成DATs在二者萃取效率不同的原因。

圖3 DATs注射液采用不同溶劑萃取后所得峰面積比較

(2)包合物中DATs萃取條件的選擇

本實(shí)驗(yàn)采用無(wú)水乙醇、正己烷、乙酸乙酯、丙酮超聲萃取包合物中DATs，對(duì)比起萃取效率。具體方法如下：

取優(yōu)化條件下獲得的DATs/β-環(huán)糊精包合物固體樣品4份，每份0.1g，分別加入無(wú)水乙醇、正己烷、乙酸乙酯、丙酮4種溶劑各3mL，封口，室溫下超聲提取（40kHz）4次，每次0.5h，過(guò)濾，濾液1μL進(jìn)GC-MS分析,將濾渣復(fù)溶于3mL丙酮，重復(fù)進(jìn)行第二次提取及測(cè)定，上述過(guò)程重復(fù)4次，比較溶劑從包合物中萃取DATs的效果。圖4分別顯示用4種不同溶劑萃取包合物中DATs的效果。由圖可見(jiàn)，使用丙酮在第一次提取以后，包合物中殘留的DATs含量較低，第二、三、四次萃取液DATs峰面積幾乎沒(méi)有變化，表明經(jīng)一次萃取后包合物殘留的DATs極少。而采用其他的幾種溶劑，經(jīng)多次萃取后，DATs在包合物中仍有較多的殘留，無(wú)法提取完全。所以，較優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件確定為：以丙酮作為溶劑，從包合物固體樣品中經(jīng)二次提取，即可將包合物中DATs完全萃取。

圖4 不同溶劑提取對(duì)包合物中DATs含量測(cè)定的影響

(3)標(biāo)準(zhǔn)直線，檢測(cè)限、回收率

取DATs標(biāo)準(zhǔn)品加丙酮稀釋成1.5mg/mL的儲(chǔ)備液，以丙酮按表稀釋成一系列的濃度（見(jiàn)表1），得到濃度標(biāo)準(zhǔn)方程：

上述樣品經(jīng)丙酮不斷稀釋測(cè)定，獲得方法的檢測(cè)限為16.7ng/mL。

方法的回收率采用在0.1g固體樣品中加入用高、中、低濃度DATs標(biāo)準(zhǔn)品丙酮溶液（1μg/mL，10μg/mL，100μg/mL），混勻密閉，室溫放置4h后，以丙酮超聲提取（40kHz）重復(fù)提取二次，每次1h，合并萃取液，取1μL進(jìn)GC-MS分析，計(jì)算結(jié)果顯示，平均加樣回收率為98.6%-101.3%。

(4)樣品測(cè)定

將4個(gè)不同包合條件下獲得的包合物樣品按2.2.3下方法分別進(jìn)行前處理后GC-MS分析，典型樣品的色譜圖如圖5。

圖5 包合物樣品的TIC圖

四個(gè)包合物樣品用本方法進(jìn)行了定量測(cè)定。樣品重復(fù)測(cè)定4次，RSD最小1.2%，最大為3.69%，方法穩(wěn)定性較好。計(jì)算結(jié)果列入表1。

表1 固體樣品中DATs分析結(jié)果（n=3）

4.結(jié)論

本研究建立了對(duì)大蒜素-環(huán)糊精包合物中的DATs定量分析方法，通過(guò)對(duì)比研究，確定了用丙酮自環(huán)糊精包合物中萃取DATs的前處理方法，實(shí)驗(yàn)表明，采用3mL丙酮對(duì)0.1g大蒜素-環(huán)糊精包合物分兩次進(jìn)行提取，可充分將包合的DATs萃取出來(lái)。方法學(xué)研究表明，采用DB-WAX色譜柱，在優(yōu)化的GC-MS條件下，可對(duì)包合物中的DATs進(jìn)行準(zhǔn)確，快速的測(cè)定。該方法的建立，為我們開(kāi)展大蒜素-環(huán)糊精包合物的工藝和穩(wěn)定性研究以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。