miR-16-5p對食管鱗癌的診斷價值和作用機制研究

馮巧燕 張波 張健 徐建峰

食管癌是世界第七大常見的癌癥，其中食管鱗狀細胞癌（以下簡稱食管鱗癌）約占90%[1]。由于其發病隱匿，多數患者初次診斷時已經處于疾病晚期。早期食管癌患者的術后5年生存率為80%～90%，而晚期患者僅為25%[2]。由此可見，食管癌的早期診斷至關重要。活體組織病理檢查是癌癥診斷的金標準，但這種診斷方法不方便且具有侵入性。因此，尋找合適的生物標志物輔助腫瘤早期診斷意義重大。microRNA（miRNA）是長度約22個核苷酸的非編碼RNA，通過降解靶mRNA或阻斷其翻譯從而調控基因表達[3]。研究表明，特定miRNA的表達異常對腫瘤增殖、血管生成和轉移起關鍵作用[4-5]。不同類型腫瘤的miRNA表達譜不盡相同，這種情況不僅存在于患者腫瘤組織內，患者的血液、唾液等miRNA表達水平也可能發生改變[6-7]。因此，檢測特定miRNA是否發生改變可能對食管癌診斷具有一定的指導作用。基于此，本研究通過基因表達匯編（gene expression omnibus，GEO）數據庫探尋食管鱗癌患者和健康人群血清中差異表達的miRNA；通過qRT-PCR實驗對浙江省臺州醫院的35例食管鱗癌患者的血清與健康人群血清中的miR-16-5p進行檢測和分析，并通過ROC曲線評估miR-16-5p作為食管鱗癌生物標志物的潛在可能；下載癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據分析miR-16-5p在食管鱗癌組織中的表達，初步分析其作用機制，以期為miR-16-5p成為食管鱗癌生物標志物提供理論支持，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 采集浙江省臺州醫院2015年9月至2019年6月收治的病理學檢查確診為食管鱗癌的35例患者的血液標本和35例健康體檢者的血液標本，標本均由中心實驗室規范保存。35例食管鱗癌患者中男27例，女8例；年齡＜60歲22例，≥60歲13例；腫瘤位于食管中段～中上段13例，中下段～下段22例；N0或Nx期21例，N1～2期14例。本研究經醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 GEO數據篩選 從GEO數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中下載 GSE71043數據集，共3例食管鱗癌患者血清和3例健康人血清的miRNA表達數據納入本研究。通過GEO2R工具篩選食管鱗癌患者血清與健康人群血清中的差異表達miRNA。

1.2.2 血清miR-16-5p表達水平檢測 受試者采用普通生化管抽取5 ml靜脈血，在常溫下3 000 r/min離心10 min（離心半徑16 cm）獲得血清標本，使用TRIzol試劑（美國賽默飛公司）提取血清標本中的總RNA。根據產品使用說明書使用miRNA逆轉錄試劑盒（美國賽默飛公司）制備cDNA。采用PCR試劑（上海吉瑪公司）配制反應體系進行PCR擴增，以cel-miR-39為內參標準化，使用 2-ΔΔCt方法進行相對定量分析。miR-16-5p的上游引物：5'-GATCTTGAAGGGGACCGCAATGGA-3'，下游引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。cel-miR-39的上游引物：5'-CACTCCGTCACCGGGTGTAAATC-3'，下游引物：5'-TCCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'。引物由上海生工生物有限公司（上海生工）合成。

1.2.3 TCGA數據分析 從TCGA數據庫（https://cancergenome.nih.gov/）中下載食管鱗癌高通量基因測序數據和臨床數據，共95例食管鱗癌組織和13例癌旁正常組織的miRNA表達數據納入本研究。所有miRNA表達數據采用log2進行標準化處理。

1.2.4 京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）和基因本體論（gene ontology，GO）富集分析 從miRTarBase數據庫（http://mirtarbase.cuhk.edu.cn）下載miR-16-5p的靶基因。將靶基因上傳至用于注釋、可視化和集成發現的數據庫（database for annotation，visualization and integrated discovery，DAVID）（https://david.ncifcrf.gov/）進行 EKGG 和GO功能富集分析。

2 結果

2.1 食管鱗癌患者血清與健康人群血清miR-16-5p表達水平比較 GEO數據集數據分析結果和qRTPCR檢測結果均顯示食管鱗癌患者血清miR-16-5p表達水平明顯高于健康人群血清，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表 1。

表1 食管鱗癌患者血清與健康人群血清miR-16-5p表達水平比較

2.2 miR-16-5p對食管鱗癌的診斷效能分析 利用Younden指數的ROC曲線得到能區分食管鱗癌患者與健康人群的截斷值。miR-16-5p的靈敏度為0.7143，特異度為0.8857，此時最佳截斷值為1.3351，AUC為0.802（95%CI:0.689～0.887），見圖 1。

圖1 miR-16-5p診斷食管鱗癌組織的ROC曲線

2.3 不同臨床特征食管鱗癌患者血清miR-16-5p表達水平比較 35例食管鱗癌患者中，有淋巴結轉移患者血清中miR-16-5p表達水平高于無淋巴結轉移或淋巴結轉移未知患者，差異有統計學意義（P＜0.05）；但不同性別、年齡、吸煙史、飲酒史和腫瘤位置患者血清中miR-16-5p表達水平比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表 2。

表2 不同臨床特征食管鱗癌患者血清miR-16-5p表達水平比較

2.4 食管鱗癌患者癌組織與癌旁正常組織miR-16-5p表達水平比較 TCGA數據分析結果顯示食管鱗癌患者癌組織 miR-16-5p表達水平明顯高于癌旁正常組織，差異有統計學意義（P＜0.05），見表 3。

表3 食管鱗癌患者癌組織與癌旁正常組織miR-16-5p表達水平比較

2.5 miR-16-5p在食管鱗癌中的作用機制GO和KEGG富集分析結果 從miRTarBase數據庫獲取已經證實的1 557個miR-16-5p的靶基因，對這些靶基因進行富集功能富集分析。KEGG富集結果顯示，miR-16-5p的靶基因顯著富集于PI3K-Akt、p53、Hippo等多條腫瘤相關信號通路（P＜0.05），見表4。GO富集結果顯示，miR-16-5p的靶基因顯著富集于翻譯、結合蛋白、細胞黏附等（P＜0.05），見表 5。

表4 miR-16-5p靶基因的KEGG信號通路富集結果

表5 miR-16-5p靶基因的GO富集結果

3 討論

目前，食管癌仍是當今世界最具致命性的癌癥之一。盡管預防與治療食管癌的方法和手段有所改進，但對于中晚期食管癌，這些干預性措施療效有限。尋找新型的診斷方法和合適的生物標志物顯得尤為重要。本研究探討了miR-16-5p在食管鱗癌患者血清和癌組織中的表達情況，并進一步分析其作用機制。

本研究結果顯示，血清中miR-16-5p或可作為篩查食管鱗癌患者的生物標志物。與健康人群血清相比，食管鱗癌患者血清中的miR-16-5p水平顯著上調，這一結論得到GEO數據分析結果的支持。ROC曲線分析結果顯示血清中miR-16-5p檢測食管鱗癌患者的AUC值為0.802，具備較高的靈敏度和特異度。同時，本研究還顯示血清中miR-16-5p的表達與食管鱗癌進展有關，食管鱗癌患者血清中miR-16-5p的表達水平在有淋巴轉移的患者中明顯上調，但這需要擴大樣本量進一步證實。另外，本研究顯示食管鱗癌組織中miR-16-5p的表達水平顯著上調，這表明miR-16-5p參與食管鱗癌的發生。KEGG和GO功能富集分析表明miR-16-5p可能通過調控翻譯、結合蛋白、細胞黏附從而影響食管鱗癌的發生與發展，多條腫瘤相關信號通路或參與該過程。

一系列研究已經證明循環miRNA在各種癌癥中的診斷價值。在眾多的miRNA中，miR-16-5p是最具代表性的miRNA之一。過去的研究發現miR-16-5p在非小細胞癌、肝癌、胃癌等腫瘤患者血清中均有顯著變化。Fan等[8]的研究顯示miR-16-5p診斷非小細胞肺癌的靈敏度為0.88，特異度為0.86；Qu等[9]發現miR-16-5p診斷肝癌的靈敏度為0.721，特異度為0.888；而在Wang等[10]的研究中，miR-16-5p診斷胃癌的靈敏度為0.79，特異度為0.78。上述研究表明，miR-16-5p或可作為某些特點腫瘤診斷的潛在生物標志物。近些年的研究已經證實miR-16-5p在食管鱗癌患者血清中表達上調[11-12]，這與本研究結論一致。

另一方面，大量研究發現miR-16-5p在多種腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移中起著重要作用[13-15]。Qu等[13]的研究顯示miR-16-5p通過靶向血管內皮生長因子A抑制乳腺癌細胞的增殖和侵襲并促進細胞凋亡。同時，Cheng等[14]發現miR-16-5p可通過直接靶向胰島素樣生長因子1受體（IGF1R）蛋白表達抑制肝癌細胞的侵襲和遷移。在結直腸癌，Wu等[15]發現miR-16-5p通過血管內皮生長因子A/血管內皮生長因子受體1/蛋白激酶B（VEGFA/VEGFR1/Akt軸起抑癌作用。上述研究表明miR-16-5p是多種腫瘤發生和進展的關鍵因子。

綜上所述，miR-16-5p在食管鱗癌患者血清和癌組織中均顯著上調，或可作為食管鱗癌輔助診斷的生物標志物。miR-16-5p可能通過調控翻譯、結合蛋白、細胞黏附從而影響食管鱗癌的發生、發展，多條腫瘤相關信號通路或參與該過程。