4Rs原則在人體機能學動物實驗中的應用

蔡維維，杜 斌，陳俊良，唐篩娣，邱麗穎

(江南大學無錫醫學院 人體機能學實驗中心， 江蘇 無錫 214122)

4Rs原則是指在動物實驗過程中用其他方法替代(replacement) 動物實驗； 減少(reduction) 動物的使用數量；優化(refinement) 實驗過程，減少動物痛苦；增強倫理觀念，對實驗動物要有責任感 (responsibility)。4Rs原則是美國芝加哥的倫理研究國際基金會在Russell 和Burch兩位教授最早系統地提出了科學研究中動物實驗的3Rs原則的基礎上，增加了責任(responsibility)作為第4個原則，進一步構成了4Rs原則[1-3]。醫學動物實驗是機能學實驗教學的基本途徑和有效手段，其研究對發展生物醫學和增進人類健康至關重要[4]。4Rs原則既沒有完全否定動物實驗的必要性，同時又強調了對實驗動物生命的維護和尊重，是解決動物實驗與倫理道德矛盾的可行依據。

將4Rs原則引入機能學實驗教學，是培養醫學生人文精神的重要內容，也是符合科學和倫理學發展方向[5]。近3年來，江南大學從2014、2015和2016級臨床醫學專業人體機能學系統整合課程建設著手，進一步探索4Rs原則在人體機能學動物實驗教學中的應用。

1 資料與方法

1.1 對象

江南大學2014、2015和2016級臨床醫學(5年制)共93名學生，男生32人，女生61人。

1.2 方法

1.2.1 人體生理學實驗替代動物實驗：加強以人體為實驗對象的研究以替代從動物實驗中獲取生理現象的研究與解釋，使學生了解更多的與人體機能相關的知識。江南大學購置Web Chart-400人體生理學實驗系統(成都泰盟)，極大豐富了人體生理學實驗內容。根據課程建設及臨床醫學專業特點將人體生理學實驗項目分為必修實驗項目(6個)和選修實驗項目(5個)。學生利用課外時間進行人體生理學選修實驗項目實驗，有效延伸課堂教學的內容(圖 1)。

圖1 人體生理實驗項目Fig 1 Experimental project of Human physiology

1.2.2 整合實驗項目，減少動物的使用數量：近年來通過整合實驗項目數量，優化實驗過程減少機能學實驗動物的使用數量。將家兔基本技能操作(家兔麻醉:耳緣靜脈注射、氣管插管、分離頸動脈、迷走神經、減壓神經、動脈插管和生物信號記錄等)和家兔呼吸運動調節及藥物作用(夾閉氣管、刺激迷走神經和尼可剎米等)進行整合，可以使家兔的使用數量減半。將紅細胞滲透脆性及影響血液凝固因素和離體小腸平滑肌生理特性及藥物作用實驗項目進行整合，可以使家兔的使用數量減半；實施方法為先將家兔頸動脈插管放血儲存，用于紅細胞滲透脆性及影響血液凝固因素實驗；繼續打開腹腔解剖回腸，用于離體小腸平滑肌生理特性及藥物作用實驗。將小鼠基本技能操作(標記編號、腹腔注射和灌胃等)、藥物ED50(50% effective dose)的測定和藥物鎮痛作用實驗項目進行整合；實施方法為藥物ED50的測定和藥物鎮痛作用實驗都需要標記編號、腹腔注射和灌胃，藥物鎮痛作用實驗需要進行小鼠痛閾值篩選；痛閾不敏感的小鼠實行淘汰，可用于藥物ED50的測定。將神經干動作電位測定(示教)、坐骨神經腓腸肌標本制備、骨骼肌收縮的影響和離體蛙心實驗項目進行整合，達到減少蟾蜍的使用數量；實施方法為先進行動作電位測定(示教)、坐骨神經腓腸肌標本制備、骨骼肌收縮的影響實驗項目，同時將解剖下來的離體蛙心用于另一個班級實驗(圖2)。整合實驗項目不僅僅局限于機能學實驗，可進一步拓展到生物化學實驗，如收集失血性家兔的血液備用于凝膠層析法分離血紅蛋白。

圖2 整合實驗項目數量Fig 2 Number of integrated experimental projects

1.2.3 優化實驗過程，減少動物痛苦：以家兔肝性腦病模型建立為例，在實驗方法改良前，家兔采用腹部切口局部麻醉進行肝葉結扎切除；家兔在手術過程前期表現恐懼、驚慌導致小便失禁等。通過優化實驗過程改良實驗方法，對家兔采用全身麻醉進行肝葉結扎切除；待家兔意識清醒后再采取氯化銨造模，同樣能觀察到家兔意識清醒狀態下的全身抽搐的表現，以減少家兔的痛苦(圖3)。通過課前的虛擬仿真實驗、微課、視頻等方法預習，避免實驗操作失誤，減少在實驗過程中動物的痛苦。江南大學于2016年建立機能學虛擬仿真實驗室，“虛實結合”用于機能學實驗教學(圖4)。將虛擬仿真實驗項目作為實驗課前預習實驗基本要求，以便學生熟悉動物實驗的目的、實驗藥品與設備、實驗步驟、實驗操作注意事項等，幫助學生樹立“珍愛生命、換位思考”的觀念。在實驗過程中發現因實驗流程和操作失誤導致動物死亡，本組同學實驗成績記不及格，如烏拉坦耳緣靜脈注射，因靜脈推注過快導致家兔死亡；家兔氣管插管不當導致氣道堵塞家兔死亡； 家兔頸動脈插管因動脈打結不牢固至插管滑脫引起大出血至家兔死亡等。

圖3 肝葉大部分結扎Fig 3 Mostly ligated of livers

圖4 虛擬仿真實驗項目Fig 4 Virtual simulation experiment project

1.2.4 增強倫理觀念，對實驗動物要有責任感：在機能學實驗教學過程中通過實驗室的實驗動物慰靈牌(魂歸自然、功留人間)對實驗動物要有責任感，以加強醫學生的倫理觀教育(圖5)。在機能學實驗教學中，將動物倫理觀融入到每一步實驗操作中，如: 根據實驗指導要求20%烏拉坦(5 mL/kg)麻醉家兔，因家兔體質存在個體差異而麻醉效果不同，進而需要在實驗操作過程中根據家兔意識狀態等多次適量補注麻醉藥烏拉坦。家兔在實驗過程中有痛苦掙扎或麻醉狀態過淺，應停止實驗操作，適量補注麻醉藥烏拉坦。實驗結束后準確地記錄每只家兔烏拉坦使用的總量及家兔生命體征狀況。

圖5 實驗動物慰靈牌Fig 5 Laboratory animal comfort card

1.2.5 實驗教學效果調查問卷：為充分了解并評估學生針對人體機能學動物實驗的教學需求，課后采用調查問卷的形式，收集學生對于4Rs原則實驗教學的反饋意見，問卷包括以下幾個問題: 1)實驗動物福利與實驗動物教學關系上，是否能做到以教學為主，同時兼顧到實驗動物福利？選項為能做到、不能兼顧和有時可以有時不能說不清楚；2)在動物實驗過程中是否同情實物動物？選項為同情、不同情和不知道很矛盾；3)在動物實驗過程中是否有虐待實物動物的行為？選項為有和沒有；4)看到身邊同學有虐待實物動物的行為是否去阻止？選項為否和及時去阻止；5)實驗動物的處死方法是否要彰顯人道主義精神？選項為需要、不需要和不知道很矛盾；6)是否了解中國實驗動物管理條例以及實驗動物保護法律法規？選項為了解、一般了解和不了解。

1.3 統計學分析

發放紙質調查問卷，對數據進行分析，主要統計方法為描述性分析。

2 結果

發放問卷調查學生數為93人，發放問卷調查93份，收回問卷87份，回收比例為93.5%。問卷調查結果顯示，92.0%醫學生在動物實驗過程中主動同情實驗動物，積極主動做到以教學為主，同時兼顧到實驗動物福利。100%醫學生做到實驗動物的處死方法要減少動物的痛苦，彰顯人道主義精神(表1)。

表1 醫學生對4Rs原則在動物實驗中的認知

3 討論

人文素質教育要遵循人的思想發展規律，“小火慢燉”、循序漸進， 讓大學生人文素質教育融合、滲透到專業教學中去，具有重要意義[6]。在現實環境下，醫學人文素質和醫療技術同等重要，醫學生不僅要具備扎實的醫療技術，還要有豐富的人文底蘊[7]。4Rs原則與醫學人文教學是一脈相承的，其目的是指通過替代而減少動物的使用并將動物的痛苦降到最低。在實驗教學過程中逐步運用麻醉藥物動物處死替代小鼠脫頸(脊髓)處死、大鼠斷頭處死、家兔靜脈空氣肺栓塞處死、家兔腦干錘擊致死等。通過改進動物處死的方法來教育和感化醫學生，提高學生們的思想認識和自我責任感，使學生們熱愛醫學、珍愛生命。規章制度是4Rs原則實施的根本保證，而規章制度的生命力在于執行。近年來，江南大學醫學院動物實驗中心逐步建設與完善其規章制度，如實驗動物管理條例、動物福利倫理委員會、動物福利與倫理申請審查表、動物操作技術、麻醉、安樂死相關培訓等。

目前，江南大學4Rs原則在機能學實驗教學中還處于探索階段，特別是通過整合實驗項目，減少動物數量的使用。實驗項目的整合需要考慮到理論課程各系統的關聯性和教學進度。此外，問卷調查結果提示需要加強醫學本科生對我國實驗動物管理條例以及實驗動物保護法律法規的學習教育。醫學以人為對象，醫生在重視醫學科學本身的同時，也需要體現人性的關懷，而且這種人性關懷往往會起到不可或缺的作用[8]。因此，4Rs原則為醫學人文教育的發展注入了新的生命力，為今后的人體機能學動物實驗教學提供了新的思路與方法。