HIF-1α激動劑或拮抗劑對膿毒癥大鼠腸道黏膜通透性的影響

王玉龍，滕文彬，單 躍，姚劉旭，何 銳，李玉紅，祝勝美*

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 麻醉科， 浙江 杭州 310000； 2.紹興市人民醫(yī)院 麻醉科，浙江 紹興 312000；3.樹人大學(xué)樹蘭國際醫(yī)學(xué)院附屬樹蘭(杭州)醫(yī)院 麻醉科， 浙江 杭州 310004)

膿毒癥(sepsis)是機體對感染反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙[1]，是一個公認的全球健康問題，嚴(yán)重威脅人類生命安全。2017年全球統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示[2]，sepsis年發(fā)病例4 890萬例，死亡病例約110萬例，死亡率為19.7%；拯救sepsis運動指南為臨床管理sepsis患者提供一些列循證醫(yī)學(xué)建議，在sepsis發(fā)病機制方面仍然存在很多認識空白[3]。低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor, HIF)是人體對適應(yīng)低氧環(huán)境的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在急性低氧反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。近年來，腸功能障礙對sepsis結(jié)局的影響受到研究者重點關(guān)注。Sepsis早期腸上皮細胞低氧能量障礙是腸功能障礙重要誘因，機體可能通過上調(diào)HIF-1α，促進能量代謝，改善膿毒性腸道黏膜屏障(intestinal mucosal barrier,IMB)損傷，二甲基乙二酰基甘氨酸(dimethyloxallyl glycine, DMOG)是脯氨酰羥化酶的抑制劑，可以抑制脯氨酰羥化酶從而上調(diào)HIF-1α表達；而拮抗劑BAY87-2243作用相反，下調(diào)HIF-1α表達。本研究旨在探索HIF-1α激動劑DMOG或拮抗劑BAY87-2243對膿毒癥大鼠腸道黏膜通透性作用。為sepsis腸道黏膜屏障功能損傷救治提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：選擇SPF級Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠24只，200～250 g[浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，許可證號：SCXK (浙)2-14-0001]。研究方案經(jīng)過紹興市人民醫(yī)院動物倫理委員會議討論通過(倫理審批文號：2020-009)。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備：二胺氧化酶(diamine oxidase, DAO)和腸型脂肪酸結(jié)合蛋白2(intestinal type fatty acid binding protein 2, I-FABP/FABP2)試劑盒(Cloud-Clone公司)；D-乳酸(D-lactic)試劑盒(Abebio公司)；熒光素標(biāo)記的右旋糖苷(fluorescein isothiocyanate-dextran, FD4)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(Sigma-Aldrich公司)； HIF-1α、ZO-1(zonula occludens-1)、occludin、claudin-1和GAPDH一抗(Abcam公司)；二甲基乙二酰基甘氨酸(dimethyloxaloylglycine,DMOG)和BAY87-2243(MedChemExpress公司)；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG(Jackson公司)。SpectraMax Plus全波長酶標(biāo)儀(上海美谷分子儀器有限公司)；ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)和Quantity one 4.6圖像處理與分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；R510IP小動物麻醉機(深圳瑞沃德公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組及處理：將大鼠隨機數(shù)字法分為sham組(n=6)、sepsis組(n=6)[用盲腸結(jié)扎穿孔(ligation and perforation, CLP)]、(sepsis+DMOG)組(n=6)[CLP術(shù)前連續(xù)7 d腹腔注射DMOG(40 mg/kg)]；(sepsis+BAY87-2243)組(n=6)[CLP術(shù)前連續(xù)3 d灌胃BAY87-2243(9 mg/kg)]。

1.2.2 標(biāo)本的采集與處置：大鼠采用七氟烷麻醉后，分離出4 cm小腸，用手術(shù)縫線分別結(jié)扎腸管兩端，將50 μg的FD4，藥物配制濃度為100 mg/mL，注入腸管內(nèi)，1 h后取門靜脈0.5 mL，用于測定FD4血漿濃度。之后取腹主動脈血2 mL，低溫離心后分裝置于-80 ℃保存，用于檢測DAO、FABP2、D-lactic血漿濃度。距離盲腸部2 cm處取1 cm回腸組織數(shù)段，部分制成蠟塊用于形態(tài)學(xué)研究；部分分裝置于-80 ℃存儲，用于檢測腸黏膜緊密連接(tight junctions, TJs)和HIF-1α蛋白的表達。隨后頸椎脫臼法處死大鼠。

1.2.3 HE染色檢測大鼠腸黏膜形態(tài)學(xué)變化：常規(guī)HE染色光鏡下觀察小腸黏膜形態(tài)學(xué)改變，采用Chiu’s 評分定量判定小腸組織損傷程度。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測DAO、FABP2和D-lactic血漿濃度：按照ELISA試劑盒說明書檢測各標(biāo)本DAO、FABP2和D-lactic血漿表達水平。每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)3個復(fù)孔，獲得酶標(biāo)儀450 nm處吸光值(A)，根據(jù)吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各樣本DAO、FABP2和D-lactic的含量，取平均值。

1.2.5 FD4濃度的測定：解凍后血漿作1∶8倍稀釋，轉(zhuǎn)移到96孔板，每個標(biāo)本做個復(fù)孔，每個孔100 μL。用熒光酶標(biāo)儀測定FD4血漿濃度。激發(fā)波長和發(fā)射波長分別設(shè)定為490 nm和520 nm。

1.2.6 Western blot測定小腸黏膜TJs和HIF-1α蛋白的表達： 具體操作步驟按常規(guī)方法進行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α激動劑或拮抗劑對sepsis大鼠腸黏膜病理形態(tài)的影響

Sham組大鼠腸黏膜完整，絨毛整齊(圖1A)；Sepsis組膜黏膜完整性破壞，腸絨毛萎縮脫落；(sepsis+DMOG)組大鼠腸絨損傷程度介于sham組和sepsis組之間；而(sepsis+BAY87-2243)組絨毛損傷比sepsis組更嚴(yán)重，甚至出現(xiàn)潰瘍。Chiu’s評分與黏膜損傷程度成正比，具體見圖1A，B。

2.2 各組大鼠DAO、FABP2、D-lactic和FD4血漿的比較

與sham組相比，sepsis組大鼠DAO、FABP2、D-lactic和FD4血漿濃度均增高(P<0.05)(圖2A～D)。與sepsis相比，(sepsis+DMOG)組DAO、FABP2、D-lactic和FD4血漿濃度均明顯降低(P<0.05)(圖2A～D)；(sepsis+BAY87-2243)組大鼠DAO、FABP2、D-lactic和FD-4血漿濃度均顯著升高(P<0.05)(圖2A，D)。

2.3 各組大鼠腸黏膜組織TJs和HIF-1α表達的比較

與sham組相比，sepsis組大鼠腸黏膜組織中HIF-1α的表達水平上調(diào)(P<0.05)(圖3A，B)，而TJs蛋白(ZO-1、occludin和claudin-1蛋白)的表達水平明顯下調(diào)(P<0.05)(圖3A，C～E)。與sepsis相比(sepsis+DMOG)組腸黏膜組織中HIF-1α、ZO-1、occludin和claudin-1蛋白的表達均顯著上調(diào)P<0.05)；而(sepsis+BAY87-2243)組相反，腸黏膜組織中上述蛋白表達水平均下調(diào)(P<0.05)(圖3,表1)。

表1 HIF-1α激動劑或拮抗劑對大鼠腸黏膜HIF-1α和TJs蛋白表達的影響

A.images of intestinal morphology, the pathological status of intestinal mucosal barrier villi and lamina propria in the treated animals was shown at the arrow (HE staining,×200); B.intestinal mucosa injury was quantitative assessed by Chiu’s Score; *P<0.05 compared with sham group; #P<0.05 compared with sepsis group

*P<0.05 compared with sham group; #P<0.05 compared with sepsis group圖2 HIF-1α激動劑或抑制劑對大鼠血漿DAO(A)、FABP2(B)、D-lactic(C)和FD4(D)的影響

3 討論

Sepsis是一種危及生命的臨床綜合征，可導(dǎo)致自身組織和器官損傷，引起多個器官功能障礙[1]。危重患者腸道致病菌過度繁殖，腸黏膜受損，細菌毒素進入血循環(huán)，進而發(fā)展為全身性炎性反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)或多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)，因此，腸道是sepsis的“啟動器官”。Sepsis中，腸黏膜微循環(huán)障礙，腸道黏膜屏障受損；通過腸道-淋巴通路使腸功能衰竭進一步惡化，腸道又是sepsis的“中心器官”[5]。

DAO和FABP2在腸黏膜細胞中表達， 腸黏膜損傷細胞脫落時，快速釋放進入血循環(huán)，可以作為腸黏膜損傷的特異性標(biāo)志物[6]。D-lactic是腸道細菌的代謝產(chǎn)物， 腸黏膜損傷致通透性增加時，D-lactic入血，哺乳動物不能代謝D-lactic，因此，血D-lactic濃度增加間接反映腸道通透性增加[6]。FD4是腸道通透性和腸道屏障改變的標(biāo)志物[7]。本研究中，sepsis大鼠上述血漿標(biāo)志物均升高，提示sepsis導(dǎo)致大鼠腸黏膜損傷，通透性增加。

TJs是維系細胞間鏈接與細胞屏障的重要組成部分。Occludin維持腸道物理特性，具有黏附功能；claudin-1形成細胞旁離子的選擇性通道，影響著細胞間物質(zhì)滲透率[8]；ZO-1與多種細胞骨架蛋白綁定，對TJs起到支撐骨架作用[9]。本研究中，sepsis大鼠腸黏膜組織中TJs相關(guān)蛋白ZO-1、occluden、claudin-1的表達水平下降，病理形態(tài)破壞，提示sepsis導(dǎo)致大鼠腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞。

生理狀態(tài)下，腸上皮細胞暴露于“生理性低氧”環(huán)境中，低氧環(huán)境是腸道共生菌生存的物質(zhì)基礎(chǔ)，并促進腸道物質(zhì)運輸[10]；炎性反應(yīng)時，氧耗增加、血管收縮導(dǎo)致氧供降低，腸上皮細胞出現(xiàn)缺氧[11]。本研究中，sepsis大鼠腸黏膜中HIF-1α表達明顯增加，明顯高于正常組，提示sepsis造成腸黏膜細胞缺氧，黏膜細胞通過自身代償性HIF-1α的表達上調(diào)，以提高對缺氧的耐受并促進增殖維護腸道黏膜屏障的完整。既往研究使用HIF-1α激活劑明顯減輕CLP引起小鼠腎臟損害[12]。在結(jié)腸炎小鼠中，HIF-1α激活劑AKB-4924能增強小鼠腸黏膜屏障功能，但是對HIF-1α缺陷小鼠無腸黏膜保護作用，表明腸黏膜HIF-1α是AKB-4924介導(dǎo)保護的組織靶點[13]。腸道HIF-1α敲除小鼠加劇腸酒精性腸道黏膜屏障的破壞[14]。通過敲除和過表達實驗發(fā)現(xiàn)HIF在基因啟動子水平上對claudin-1的表達起著基本的調(diào)節(jié)作用，揭示claudin-1可能是HIF的一個重要靶基因，HIF缺陷型腸黏膜claudin-1表達異常，導(dǎo)致TJs形態(tài)異常[15]。本研究中給予sepsis大鼠DMOG，sepsis大鼠腸道HIF-1α和TJs相關(guān)蛋白的表達上調(diào)，腸道黏膜損傷緩解。而給予BAY87-2243，出現(xiàn)HIF-1α和TJs相關(guān)蛋白表達下調(diào)，腸黏膜損傷緩解加重。

A.expression bands; B-E.protein expression of HIF-1α, ZO-1, occudin, and claudin-1; *P<0.05 compared with sham; #P<0.05 compared with sepsis

綜上所述，sepsis時大鼠腸道黏膜屏障的結(jié)構(gòu)和功能受到嚴(yán)重破壞，黏膜細胞通過自身調(diào)節(jié)HIF-1α表達上調(diào)。給予HIF-1α激動劑DMOG通過降低腸黏膜通透性，調(diào)節(jié)TJs中claudin-1而發(fā)揮保護腸道黏膜屏障作用，緩解膿毒引起的腸道黏膜屏障損傷作用；而給予HIF-1α抑制劑BAY87-2243，作用相反。結(jié)果提示HIF-1α對sepsis大鼠通過降低腸黏膜的通透性，發(fā)揮對膿毒癥腸黏膜損傷具有保護作用，具體機制有待于進一步探索。