腦和脊髓動靜脈畸形血管中蛋白質(zhì)表達譜的差異

王乃利，孟 姝，仇文穎，王 霞

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 1.人體解剖與組織胚胎學(xué)系；2.免疫學(xué)系，北京 100005)

動靜脈畸形(arteriovenous malformation，AVM)是一類動靜脈血管間異常連接的罕見血管疾病，易破裂出血，是患者致殘的重要風險因素。常發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，包括腦動靜脈畸形(brain AVM，bAVM)和脊髓動靜脈畸形(spinal AVM，sAVM)[1]。

對AVM發(fā)病機制的研究多集中于bAVM， 如血管形成異常，包括血管生成抑制基因 miR-137和miR-195*表達降低[2]、Sox2(transcription factor SOX-2，轉(zhuǎn)錄因子SOX-2)-JMJD5(bifunctional peptidase and arginyl-hydroxylase JMJD5，雙功能肽酶和精氨酸羥化酶)作用引起內(nèi)皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-mesenchymal transition，End-MT)[3]，細胞間通訊異常[4]。在sAVM發(fā)現(xiàn)細胞外基質(zhì)和血管形成相關(guān)蛋白質(zhì)表達量異常[5]。

此外，在bAVM和sAVM中均發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細胞的富集[6]、及KRAS(GTPase KRas，GTP酶)/BRAF(serine/threonine-protein kinase B-raf，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶)突變[1]誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞MAPK-ERK(mitogen-activated protein kinase，絲裂原活化蛋白激酶)通路激活[7]。尚無報道兩種疾病間的分子表達特異性。對比bAVM和sAVM的蛋白質(zhì)表達差異，對深入研究bAVM和sAVM的分子機制，開發(fā)疾病特異性的診斷或治療方法具有重要指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料: 患者bAVM標本(4例)和sAVM標本(4例)來自于清華長庚醫(yī)院，對照組腦血管(4例)和脊髓血管(4例)來自于國家發(fā)育和功能人腦組織庫，對照組捐獻者無神經(jīng)系統(tǒng)和血管系統(tǒng)相關(guān)疾病。標本詳細信息參見表1。所有標本于-80 ℃保存。本研究已獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所倫理委員會審核(倫理批準號：2018008)。經(jīng)患者知情同意。

表1 入組患者基本信息Tabel 1 Patient’s information

1.1.2 試劑:尿素(urea)、二硫蘇糖醇和碘乙酰胺來自于GE Healthcare公司；蛋白酶抑制劑cocktail來自于Roche公司；Tandem Mass TagTM(TMT)試劑、PBS、甲酸、乙腈、蛋白marker(Thermo Scientific公司)；Trypsin/Lys-C(Promega公司)；三乙基碳酸氫銨溶液、羥胺、考馬斯亮藍染液(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 方法

1.2.1 組織蛋白的提取:在冷PBS中去除組織中血污染，去除bAVM標本中黏連的腦組織。標本在液氮中迅速冷凍并研磨成粉，加入冷組織裂解液(8 mol/L urea的PBS溶液，含蛋白酶抑制劑cocktail)，4 ℃裂解40 min，12 000×g離心10 min取上清即為組織蛋白提取液。使用超微量分光光度計(NanoDrop 2000)測定蛋白質(zhì)濃度。

1.2.2 蛋白質(zhì)的還原、烷基化和TMT標記: 組內(nèi)按等質(zhì)量混合各樣本蛋白質(zhì)，制備混合蛋白液。每組取100 μg上述蛋白液，加入10 mmol/L二硫蘇糖醇，37 ℃反應(yīng)1 h，然后加入25 mmol/L 碘乙酰胺，室溫反應(yīng)1 h。加入Trypsin/Lys-C 37 ℃反應(yīng)過夜，將蛋白酶解成肽段。脫鹽后，0.2 mol/L三乙基碳酸氫銨溶液溶解肽段，各組加入0.8 mg TMT試劑室溫標記1 h：TMT-126標記bAVM，TMT-128標記對照腦血管，TMT-129標記sAVM，TMT-131標記對照脊髓血管。加入羥胺中和游離的TMT分子，混合各組樣品后脫鹽。

1.2.3 高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)分級和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatograph-mass spectrometry，LC-MS/MS)的檢測:為了提高質(zhì)譜檢測到的蛋白質(zhì)數(shù)量，使用HPLC對肽段進行分組。簡要步驟為：多肽溶解于100 μL 1%甲酸溶液中，注入HPLC分離。分離色譜柱為Xbridge BEH300 C18 柱子(4.6 mm×250 mm，Waters)，柱溫維持45 ℃；流動相為乙腈和水(pH=10)，流速為1 mL/min；紫外吸收波長設(shè)為214 nm。每1.5 mL收集為1管，最終合并為12組分，旋蒸去除所有溶劑。

將上述12組分分別溶解于20 μL 1%甲酸溶液中，進行LC-MS/MS (Thermo Q Exactive質(zhì)譜儀)檢測。梯度洗脫條件：C18分析色譜柱(300 ?，75 μm×150 mm)，0.30 μL/min，120 min。質(zhì)譜檢測條件：Q Exactive質(zhì)譜采取數(shù)據(jù)依賴性采集模式，Orbitrap(400-1 800 m/z，60 000分辨率)中行全譜掃描，隨后以27%碰撞能量(higher-energy C-trap dissociation，HCD)進行10次數(shù)據(jù)依賴的MS/MS掃描。

質(zhì)譜獲得的數(shù)據(jù)使用Proteome Discoverer 2.2軟件進行搜庫，人源fasta數(shù)據(jù)庫于2020年10月在Uniprot網(wǎng)站下載。

1.2.4 生物信息學(xué)分析:可信蛋白質(zhì)的篩選條件設(shè)置為：unique peptide≥2，F(xiàn)DR≤0.01，差異蛋白質(zhì)的篩選條件設(shè)置為：變化倍數(shù)≥2.0或≤0.5。蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)分析使用到多個分析平臺和軟件：悟空云平臺(https://www.omicsolution.org/wkomics/main/)進行PCA、HCA、相關(guān)性分析，F(xiàn)unrich軟件進行Gene Ontology分析，Cytoscape軟件進行ClueGO和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析，網(wǎng)絡(luò)版WEB-based GEne SeT Analysis Toolkit進行Wikipathway分析，GraphPad Prism輔助作圖。

1.2.5 蛋白質(zhì)表達水平的驗證:通過Western blot驗證蛋白質(zhì)在bAVM、sAVM、對照腦血管和對照脊髓血管中的表達水平。由于蛋白質(zhì)總量有限，將各組的樣本按照等質(zhì)量混合。使用NanoDrop2000超微量分光光度計測定濃度后，將各組蛋白質(zhì)進行SDS-PAGE分離，通過考馬斯亮藍染色確定各組上樣量。將等質(zhì)量蛋白通過SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5%脫脂奶粉封閉后，使用1∶1 000稀釋的一抗(MMP9，ab137867，Abcam；VDAC，cst-4866，Cell Signaling Technology公司)在4 ℃ 孵育過夜。與辣根過氧化物酶標記的二抗孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法檢測抗原抗體結(jié)合條帶。

2 結(jié)果

2.1 高通量質(zhì)譜檢測bAVM和sAVM中蛋白質(zhì)表達譜的異同

在對照腦血管、bAVM血管、對照脊髓血管、sAVM血管中共檢測到3 102個高可信度蛋白質(zhì)。對照組腦血管和脊髓血管的蛋白質(zhì)表達譜相近，相關(guān)性系數(shù)為0.98，bAVM畸形血管中蛋白質(zhì)的表達豐度與其他3組的差異最大(圖1)。

A.PCA analysis；B.HCA analysis；C.correlation analysis圖1 對照腦血管和脊髓血管的蛋白質(zhì)表達譜相近Fig 1 Similar protein profiling in control cerebral vessels and spinal vessels

bAVM畸形血管中蛋白質(zhì)表達量發(fā)生變化的蛋白質(zhì)數(shù)量更多(圖2A)。相比于對照組血管，bAVM畸形血管中286個蛋白質(zhì)的表達量下調(diào)，566個蛋白質(zhì)的表達量上調(diào)；sAVM畸形血管中90個蛋白質(zhì)的表達量下調(diào)，115個蛋白質(zhì)的表達量上調(diào)。bAVM和sAVM中表達量變化的蛋白質(zhì)共941個，其中116個蛋白質(zhì)在兩種畸形血管中的表達量均顯著改變(圖2B)。在本研究中，將這941個蛋白質(zhì)定義為全部差異表達蛋白質(zhì)。

941個差異表達蛋白質(zhì)的HCA分析結(jié)果顯示(圖2C)，這些蛋白質(zhì)可分為12個cluster，其中cluster 4中304個蛋白質(zhì)僅在bAVM血管中顯著高表達，cluster 5中97個蛋白質(zhì)僅在sAVM血管中顯著高表達。后續(xù)對cluster 4和cluster 5中的蛋白質(zhì)分別進行分析。

A.satter plot displayed protein expression alterations in bAVM and sAVM；B.venn map showed that a total of 941 DEPs were detected,among which 116 proteins were found in both groups；C.HCA analysis of 941 DEPs,proteins in cluster 4 were specially upregulated in bAVM,and proteins in cluster 5 were specially upregulated in sAVM

2.2 bAVM畸形血管細胞中線粒體穩(wěn)態(tài)及鈣調(diào)節(jié)失衡

在bAVM中顯著高表達的304個差異表達蛋白質(zhì)主要為線粒體及相關(guān)蛋白質(zhì)，富集于線粒體復(fù)合物I、電子傳遞鏈、鈣調(diào)節(jié)等信號通路(圖3)。

FDR.false discovery rate; A.gene ontology analysis; B.wikipathway analysis of 304 proteins in cluster 4圖3 bAVM畸形血管中線粒體穩(wěn)態(tài)及鈣調(diào)節(jié)失衡Fig 3 Mitochondria dysfunction and calcium dysregulation in bAVM

2.3 sAVM中細胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)及其糖基化異常

sAVM畸形血管中顯著高表達的97個蛋白質(zhì)(cluster 5)主要是以ADAM10(disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10)、MMRN1(multimerin-1)、TNC(tenascin)、VCAN(versican core protein)、KNG1(kininogen-1)、LAMB1(laminin subunit beta-1)為核心的細胞外基質(zhì)蛋白或糖蛋白(圖4)。

A.gene ontology; B.protein-protein interaction analysis of 97 proteins in cluster 5圖4 sAVM中細胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)及其糖基化異常Fig 4 Alteration of extracellular matrix organization and proteoglycans in sAVM

2.4 Western blot檢測bAVM和sAVM中蛋白質(zhì)表達水平

線粒體蛋白VDAC(voltage-dependent anion channel)在bAVM中顯著高表達，細胞外基質(zhì)蛋白MMP9(matrix metalloproteinase-9)在sAVM中顯著高表達(圖5)。

A.coomassius blue staining；B.Western blot analysis圖5 Western blot檢測VDAC和MMP9在bAVM和sAVM中的表達水平Fig 5 Western blot verification of VDAC and MMP9 in bAVM and sAVM

3 討論

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)以蛋白質(zhì)組為研究對象，可無偏見的、在整體水平探究細胞或組織的蛋白質(zhì)組成及其動態(tài)變化規(guī)律。探究bAVM和sAVM的蛋白質(zhì)組表達，可系統(tǒng)地評估兩種疾病的相似和差異，為尋找疾病的特異性分子機制或靶標提供線索。

前期蛋白質(zhì)組學(xué)研究報道，參與細胞間通訊的分子黏附通路蛋白質(zhì)的表達水平在人bAVM和sAVM畸形血管中均顯著改變[4-5]。本文中，作者發(fā)現(xiàn)線粒體穩(wěn)態(tài)及鈣調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白質(zhì)的表達水平在bAVM中明顯改變，細胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)在sAVM中顯著高表達。該結(jié)果揭示了bAVM和sAVM特異性的分子特征，為充分理解bAVM和sAVM的分子機制提供參考和補充。

線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)重要的鈣離子儲存器，VDAC是線粒體外膜上高表達的鈣轉(zhuǎn)運蛋白，通過Grp75(glucose related protein 75)偶聯(lián)IP3Rs形成大分子轉(zhuǎn)運體，介導(dǎo)線粒體外膜將鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運至線粒體內(nèi)[8]。鈣離子可直接激活電子傳遞鏈和ATP合酶的活性，促進ATP生成[9]，調(diào)控線粒體能量代謝。在心肌細胞中，抑制線粒體復(fù)合物I可引起線粒體能量異常，導(dǎo)致細胞死亡[10]。本文結(jié)果顯示bAVM中多個線粒體復(fù)合物I蛋白的表達水平顯著升高，推測線粒體穩(wěn)態(tài)及鈣調(diào)節(jié)失衡在bAVM的病理過程中可能具有重要調(diào)節(jié)作用。

細胞外基質(zhì)是存在于細胞間的動態(tài)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，由膠原、蛋白聚糖、彈性纖維等大分子物質(zhì)組成。通過與細胞表面上的受體結(jié)合，調(diào)控細胞骨架結(jié)構(gòu)，引起細胞內(nèi)細胞傳導(dǎo)，影響細胞的增殖和分化。基質(zhì)金屬蛋白酶ADAM10-Notch通路、細胞外基質(zhì)糖蛋白TNC-RhoA/ROCK通路可影響內(nèi)皮細胞間緊密連接參與血管結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)[11-13]。細胞外基質(zhì)黏附蛋白MMRN1結(jié)合內(nèi)皮細胞 vWF(von Willebrand factor)，穩(wěn)定血小板黏附[14]。通過ADAMTS5水解VCAN成為versikines，促進血管內(nèi)皮細胞的黏附、增殖，促進新生血管形成[15]。在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)以ADAM10、TNC、VCAN、MMRN1為核心的細胞外基質(zhì)蛋白及糖蛋白的表達水平在sAVM中過表達，在bAVM中的變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示細胞外基質(zhì)組成對sAVM血管結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定具有重要調(diào)控作用。

本文仍存在一定的局限性：本文結(jié)論是基于小樣本量蛋白質(zhì)組學(xué)分析的推測，需在大數(shù)量樣本上進行驗證，并在細胞水平進一步證實該結(jié)論。