外源添加劑對蘋果中花青苷影響的研究進展

孫媛媛

(江蘇省南京市秦淮中學 江蘇南京 211100)

一、花青苷的概念

花青苷極不穩定，主要以水溶性的花青苷形式存在，顏色與pH有關，pH小于7時為紅色，pH在7左右時為紫色，pH大于7時呈藍色。目前，有250多種花青素為天然存在的，已確定的有20種，其中常見的有6種植物花青素，即天竺葵色素（Pg）、矢車菊色素（Cy）、飛燕草色素（Dp）、芍藥色素（Pn）、牽牛花色素（Pt）和錦葵色素（Mv）。與花青素結合的糖主要為葡萄糖、木糖、半乳糖、鼠李糖等單糖和鼠李葡萄糖、槐糖等二糖，花青苷對人體有著保健作用，因此提高其含量意義重大。

二、目前在蘋果中的研究情況

Shafiq,Singh的研究以7年生克里普斯粉蘋果樹為材料，進行噴施處理。噴灑溶液的制作方法是：花青苷合成的中間體肉桂酸、對香豆酸、苯丙氨酸、L-苯丙氨酸分別溶于50ml95%乙醇中，制備其不同濃度（50-200mg/L）吐溫20（0.01%）作為表面活性劑加入每個溶液。在開花后170天噴灑每種苯丙酸/生物合成中間體的水溶液，直到徑流，對照樹保持未噴灑。結果表明：采前單次噴施L-苯丙氨酸（100mg/L），在果實成熟前3-4周噴施，最利于克里普斯粉紅蘋果表面花青苷積累。

Zheng Liu等人的研究以富士蘋果的果肉的愈傷組織為材料。樣品處理方法是：培養基中加入（ALA）或不加入（對照）50mg/L ALA，在黑暗中搖晃培養箱3小時。愈傷組織分別在光照24、48和72h后收獲，從蘋果愈傷組織轉錄組水平分析外源ALA促進華青素積累。GO富集和KEGG分析以及DEGs的花青素代謝途徑表明，ALA誘導花青素生物合成和轉運結構基因的表達變化可能是花青素積累的關鍵原因。兩個R2R3-MYB成員MdMYB10和MdMYB9可能參與了通過愈傷組織瞬時表達調控花青素生物合成的過程。此外，通過對MATE基因家族成員的鑒定、系統發育樹、表達模式、表達水平分析、順式作用元件預測和Y1H篩選，發現MdMYB10和MdMYB9可能激活MdMATE8轉錄，調控ALA處理下花青素的轉運。綜上所述，該研究揭示了ALA對蘋果花青素積累的正轉錄調控的關鍵調控因子及其可能的機制。

Sun等人的研究材料是紅肉蘋果（Malus sieversii f.niedzwetzkyana）的愈傷組織，培養基為MS+4μmol/L6-BA+2μmol/L NAA，愈傷組織接種量為0.3g。愈傷組織的培養條件為16h/8h光照/暗循環，光照強度為2000-2500L，溫度為24.2℃。紅色愈傷組織每18d傳代一次。研究結果表明：茉莉酸甲酯可促進紅肉蘋果愈傷組織中花青素的合成，其最佳濃度為10-4mol/L。脫落酸對花青素合成有抑制作用，茉莉酸甲酯可有效緩解其抑制作用，因此茉莉酸甲酯和脫落酸對紅肉蘋果愈傷組織中花青素的合成有調節作用。

Zheng等人以富士蘋果（Malus domenstica Borkh.）果肉的愈傷組織為材料，分別在含有50mg/L5-ALA、1.5mg/L124-EBL、5-ALA+24-EBL、1.0mg/L Brz和5-ALA+Brz的液體培養基中振蕩培養3h，對照組用去離子水處理。處理后，將愈傷組織轉移到只含MS的新培養瓶中連續培養72h，誘導黃酮類化合物積累。結果表明：24-EBL增強了5-ALA誘導的類黃酮合成相關結構基因和TFs的表達，導致富士肉芽組織中紅色發育和類黃酮大量積累加快。Brz阻斷了5-ALA調節基因的表達和類黃酮代謝。值得注意的是，5-ALA可與BRs信號轉導相互作用。因此，BRs參與了5-ALA誘導的花青素和黃酮醇的積累。此外，5-ALA可能還通過其他途徑調節類黃酮代謝。

路靜等人選擇選擇培養30d，株高約5cm，有10-2片葉的健康“嘎拉”蘋果組培苗葉片提取RNA進行試驗。結果顯示：蔗糖促進花青苷積累，先前研究也表明蔗糖促進花青苷積累（Ohto et al.2001；Jeong et al.2010；Solfanelli et al.2006）。本試驗中以MdSUT2為研究對象，在擬南芥中異位表達后，花青苷含量明顯高于野生型，并且處理后轉基因擬南芥可溶性糖總量及蔗糖、葡萄糖的含量均高于野生型；對“紅星”蘋果果實進行瞬時表達，發現過表達MdSUT2后，注射點周圍花青苷含量明顯高于對照，沉默MdSUT2之后，注射點周圍花青苷含量則明顯低于對照，說明MdSUT2正調控花青苷的合成與積累，定量檢測與花青苷合成相關基因的表達量，發現這些基因表達量上調，以上說明MdSUT2過表達后蔗糖及葡萄糖含量增加，糖作為一種信號分子通過激活與花青苷合成相關基因的表達來調控花青苷的合成。花青苷及可溶性糖對于果實的品質及產量至關重要，該研究提供了一種蔗糖轉運蛋白調控花青苷合成的新思路，為改善蘋果產量及果實品質開辟了新方法。

田義等人在摘袋當天對蘋果品種紅富士（Malus domestica Borkh.‘Red Fuji’）果實噴施50mg/L腐胺。綜合分析認為：腐胺處理可以促進蘋果果實著色相關的特異調控因子MYB1轉錄，進而調節花青苷合成結構基因UFGT表達，從而促進蘋果果皮中花青苷的積累。如果進一步優化腐胺濃度，有可能將其作為一種蘋果果實著色調節劑應用于生產。

Shafiq,Singh,Khan等人的研究以粉紅蘋果（Malus domestica Borkh.）為材料，濃度為10mmol/L的茉莉酸甲酯進行葉面噴施，結果表明采收之前169天噴10mmol/L的茉莉酸甲酯或在采收前186天噴灑濃度5mmol/L的茉莉酸甲酯利于花青苷積累。

Wang等人的研究以本研究以蘋果（Malus x domestica）的“奧林”的愈傷組織為材料。在MS培養基中添加1.5mg/L2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）和0.4mg/L6-芐基氨基嘌呤（6-BA），黑暗下培養三天后轉移到含0、20或40mM IAA的MS培養基上，以野生型擬南芥為對照。結果表明植物生長素誘導的信號轉導和細胞應答主要通過核中的TIR1/AFBAux/IAA-ARF信號通路。而MdARF2的過表達可以抑制蘋果愈傷組織的積累。但MdARF2與MdIAA26之間未發現互作，說明MdIAA26可能與MdARF家族其他成員互作，調控花青素的積累。

Karagiannis,Michailidis,Skodra,Molassiotis,Tanou的研究以蘋果為試驗材料，分別在花期、花期后45天和90天噴施3次30mMSiO2，160天后采樣。結果表明硅顯著促進果實和葉的花青苷積累。

An等人的研究表明：ABA促進花青素合成的可能機制是MdbZIP44與MdMYB1相互作用，激活MdMYB1介導的花青素合成。在ABA缺失的情況下，MdBT2與MdbZIP44相互作用，使其泛素化并降解，然后負調控MdbZIP44誘導的花青素生物合成的增加。相反，ABA會觸發MdbZIP44的轉錄，從而促進花青素的積累。ABA還可以抑制MdBT2的表達，釋放MdBT2通過蛋白降解調控MdbZIP44，這也有助于ABA誘導花青素的積累。然而，其他成分（X）也可能參與該途徑。

Xie等人表明ALA如何促進基因表達尚不完全清楚。試驗未測外源ALA處理蘋果果皮中血紅素的含量，但觀察到ALA處理上調了ALAD基因表達，LA降低了ALAD基因表達，這與花青素生物合成基因的調控模式相似。推測ALA處理可能增加了血紅素含量，血紅素可能作為轉錄因子，上調Myb、bHLH和Wd40基因的表達，Wd40又上調PAL、CHS和UFGT等結構基因的表達，促進花青素在蘋果皮中合成。

Seif El-Yazal，Rady將洋蔥葉提取物作為一種天然、安全的物質，可以入侵芽休眠。外源洋蔥提取物可減少開花天數，提高開花率和果實產量參數，與芽裂有關的化學成分也有所改善。洋蔥提取物中有參與不同代謝過程的成分，增加了過氧化氫、脯氨酸、總游離氨基酸、總吲哚和花青素的生物合成，降低了過氧化氫酶活性和游離酚含量。因此，洋蔥提取液作為供試液使用時，能促進蘋果芽的破芽，提高蘋果產量。

安建平等人表明，表明通過基因克隆獲得蘋果MdCRF6，該基因編碼348個氨基酸。氨基酸序列分析表明蘋果MdCRF6包含保守的CRF結構域和AP2/ERF結構域。定量表達分析結果顯示MdCRF6受細胞分裂素和鹽脅迫誘導。EMSA結果證實MdCRF6原核表達蛋白能夠結合DRE作用元件。MdCRF6轉基因蘋果愈傷組織表現出抑制花青苷積累和對鹽脅迫敏感的表型，表明MdCRF6在調節花青苷積累和響應植物鹽脅迫過程中可能發揮著重要的調控作用。

Gao Jiang等人的綜述中指出如下圖所示的花青苷通路。

A：植物花青素的生物合成途徑。蘋果花青素是糖在光照下由糖酵解途徑轉化為戊糖磷酸途徑的一種生化過程。莽草酸在這一過程中起著重要的作用，可能通過苯丙氨酸途徑形成，或在花青素的直接形成。B：通過苯丙氨酸途徑合成花青素。苯丙氨酸合成后，由苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查爾酮合酶（CHS）、查爾酮異構酶（CHI）、類黃酮3-羥化酶（F3H）、二氫類黃酮4-還原酶（DFR）、花青素合酶（ANS）和糖基轉移酶（UFGT）催化最終合成花青素。C：本研究列出的相關路徑模式圖。分別是紅蘋果中促進花青素積累的途徑和青蘋果中抑制花青素積累的途徑。

三、結束語

研究花青苷的代謝途徑，利于開發出更佳的外源添加劑，目前主要是通過外源添加、光照等方式提高其含量，促進苯丙烷代謝的花青苷合成途徑，花青苷能豐富植物顏色，提高營養價值，促進經濟價值的提高。