海豚源Kerstersia gyiorum的分離鑒定及生物學特性

魏詩謠，王麗揚，張信軍，王彥紅

(1.揚州大學獸醫學院，江蘇 揚州 225009；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，江蘇 揚州 225009)

Kerstersiagyiorum是一種革蘭陰性菌，為產堿桿菌屬成員。最初于2003年首次從人類的腿部傷口、痰液及糞便中分離出來，并通過細胞脂肪酸分析和16S rDNA基因測序鑒定[1]。根據目前已知的報道，人類感染病例包括慢性中耳炎[2]、下肢慢性傷口感染[3]、尿路感染[4]、慢性骨髓炎[5]等。Kerstersiagyiorum主要從人類下肢傷口中分離出來，迄今為止并沒有充分資料表明此菌與某些疾病有關[6]。2019年，從我國東海采集的褐色海藻表面分離出Kerstersiagyiorum[7]，表明此菌存在于海洋環境中。2016年，報告了首例從動物身上分離出Kerstersiagyiorum，是從圈養的長江江豚氣孔中分離出此菌[8]。2020年4月，本實驗室從病死海豚的肝和肺等組織中分離出Kerstersiagyiorum，并對其進行初步分析，為圈養海豚診斷、防治此類細菌感染方面提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 生化鑒定管和藥敏紙片，均購自杭州微生物試劑有限公司；瓊脂粉，購自國藥集團化學試劑有限公司；PCR反應試劑盒，購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 主要儀器 奧林巴斯CX系列生物顯微鏡(奧林巴斯工業有限公司，型號：CX21FS1C)；超凈工作臺(蘇州凈化工作臺設備有限公司，型號：SW-CJ-IL)；恒溫培養箱(上海精宏實驗設備有限公司，型號：GNP9080)。

1.3 實驗動物 清潔級BALB/c小鼠4只，雌雄各半，6周齡，購自揚州大學獸醫學院比較醫學中心。

1.4 病例背景 2020年4月，揚州某海洋館1只雌性9歲海豚發生死亡，隨即送至揚州大學動物醫院進行死亡原因調查，通過對死亡海豚進行剖檢，發現其心肌有較多散在的白斑，肺組織切面有大量結節(圖1)，隨后采集肝臟、肺臟和腎臟等內臟器官進行病原檢測。

圖1 海豚心臟和肺臟的組織病變

1.5 試驗方法

1.5.1 細菌分離 將采集備用的海豚肝臟、肺臟和腎臟等病料經滅菌接種環無菌挑取后接種于綿羊血平板(含5%綿羊血)，置于恒溫培養箱以37 ℃培養24 h，觀察結果。24 h后挑取單菌落純培養，將純培養后的分離菌進行革蘭染色鏡檢。

1.5.2 生化試驗 用滅菌接種針挑取經純培養后的單菌落接種于葡萄糖、乳糖、蔗糖、硝酸鹽和鳥氨酸等一系列生化管，石蠟封口置于37 ℃恒溫箱培養，48 h后查看結果。

1.5.3 16S rDNA序列分析法鑒定 無菌將分離菌株與去離子水混合后，采取煮沸裂解法制備DNA模板，按照寶生物工程(大連)有限公司生產的16S rDNA bacterial identification PCR kit說明書進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測部分擴增產物，剩余產物送至金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.5.4 致病性試驗 小鼠分為攻毒組和對照組，每組雌、雄各1只，參考文獻[9]中所用攻毒劑量，攻毒組小鼠腹腔注射0.2 mL菌液，菌液濃度為1×109CFU/mL，對照組注射等量生理鹽水，觀察結果。采集攻毒致死小鼠肝臟制作觸片，美藍染色觀察病原形態。并挑取肝臟組織接種于綿羊血平板，觀察培養的病原是否與分離菌一致。

1.5.5 藥敏試驗 采取藥敏紙片擴散法檢測分離菌株的藥物敏感性，挑取純化后的菌株均勻涂布在營養瓊脂培養皿并貼上藥敏紙片，18種藥敏紙片包括美洛西林(75 μg/片)、復方新諾明(23.75 μg/片)、氟苯尼考(30 μg/片)、環丙沙星(5 μg/片)、慶大霉素(10 μg/片)、丁胺卡那(30 μg/片)、諾氟沙星(10 μg/片)、阿莫西林(20 μg/片)、多西環素(30 μg/片)、頭孢曲松(30 μg/片)、多黏菌素B(300 U/片)、頭孢哌酮/舒巴坦普生(75/75 μg/片)、左氧氟沙星(5 μg/片)、頭孢噻肟(30 μg/片)、新霉素(30 μg/片)、妥布霉素(10 μg/片)、鏈霉素(10 μg/片)和卡那霉素(30 μg/片)，置于37 ℃恒溫箱培養24 h，根據美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)公布的最新抑菌藥敏試驗參照標準[9]進行判斷。

2 結果

2.1 細菌分離 挑取死亡海豚肝臟、肺臟和腎臟組織無菌接種于綿羊血平板，24 h后各組織挑取物均分離出細菌，在綿羊血平板上長出灰白色、不透明、邊緣整齊、中央略突起的中等大小菌落(圖2)。將純化后的分離菌進行革蘭染色后，顯微鏡觀察結果為革蘭陰性球菌，呈單個或雙個排列(圖3)。

圖2 海豚分離菌株菌落形態

圖3 海豚革蘭染色陰性球菌鏡檢結果(1 000×)

2.2 生化試驗 將純化后的分離菌株接種于生化管37 ℃培養48 h后，發現該菌株對葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、硝酸鹽、鳥氨酸、七葉苷、賴氨酸脫羧酶、亞硝酸鹽(產氣)、精氨酸反應均為陰性，與文獻[10]記載關于Kerstersiagyiorum的生化特性一致。

2.3 16S rDNA序列分析法鑒定 對分離菌的DNA模板進行16S rDNA的PCR擴增，電泳結果出現了500 bp左右的目的條帶，測序結果經GenBank數據庫比對，顯示其與序列號HM117848.1的Kerstersiagyiorum具有100%同源性(圖4)。

圖4 16S rDNA序列比對結果

2.4 致病性試驗 采取腹腔注射的方式攻毒，攻毒后6 h，攻毒組小鼠出現精神萎靡、顫栗、被毛粗亂的現象，18 h后臥伏不起、呼吸急促、食欲廢絕，24 h左右死亡。對死亡小鼠剖檢，見其肺臟出血、淤血，肝臟、脾臟略腫大，肝臟邊緣有出血點，腎臟色淡，胃和小腸段充滿黃色液體，腸道液化易破損(圖5)。采集攻毒致死小鼠肝臟制作觸片，美藍染色后可在顯微鏡下觀察到單個球菌(圖6)，與分離菌顯微形態一致，隨后挑取肝臟組織接種于綿羊血平板，可見到白色、不透明菌落(圖7)，與分離菌培養形態一致。

圖5 小鼠組織病變結果

圖6 小鼠肝觸片美藍染色鏡檢結果(1 000×)

圖7 小鼠肝組織分離菌株菌落形態

2.5 藥敏試驗 試驗結果表明，分離菌僅對諾氟沙星和環丙沙星耐藥，對美洛西林、復方新諾明和氟苯尼考等16種抗菌藥敏感。

3 討論

從送檢海豚的肝臟、肺臟和腎臟組織分離出菌株,通過常規細菌分離培養及生化試驗，16S rDNA序列分析鑒定為Kerstersiagyiorum。致病性試驗發現，試驗組小鼠典型的臨床癥狀為呼吸急促，呼吸頻率比較高。剖檢小鼠發現其肺部多處密布小出血點，部分肺臟組織淤血。在剖檢海豚時發現其肺組織切面有大量結節。在人類患者感染Kerstersiagyiorum的病例中，報道過1例患有呼吸機依賴性慢性呼吸衰竭病史的患者在住院期間，氣管膿性分泌物增多，檢查發現其患有支氣管炎，對其進行小支氣管肺泡灌洗，灌洗液中分離出此菌[11]。小鼠感染Kerstersiagyiorum后呼吸急促的癥狀顯著，Kerstersiagyiorum侵襲宿主呼吸系統相關機制的研究有待深入。此外，剖檢試驗組小鼠還發現其胃腸道液化嚴重，胃內有大量黃色黏稠液體，胃腸壁薄弱易碎，幾乎透明，說明Kerstersiagyiorum對宿主的消化系統有較強的攻擊性。

Kerstersiagyiorum對多種抗菌藥保持敏感性，如市面上常見的阿莫西林、慶大霉素、左氧氟沙星等。此菌對諾氟沙星和環丙沙星耐藥，諾氟沙星和環丙沙星均屬于氟喹諾酮類抗菌藥。Kitagawa等[12]、Pence等[13]和Uysal 等[14]進行的藥敏試驗結果也顯示，Kerstersiagyiorum對氟喹諾酮類抗菌藥產生耐藥性。一般來說，此類藥物對革蘭陰性桿菌較為有效。推測因為Kerstersiagyiorum不是常見菌，接觸各類抗生素的時間較少，所以耐藥性較弱。本次藥敏試驗結果可作為治療Kerstersiagyiorum感染的參考依據。