幾種布魯氏菌ELISA抗體試劑盒對牛血清的臨床檢測評價

葉 鋒，劉麗婭，馬曉菁，謝彩云，谷文喜，馬俊杰，易新萍，鐘 旗

(新疆畜牧科學院獸醫研究所 新疆畜牧科學院動物臨床醫學研究中心，新疆 烏魯木齊 830099)

布魯氏菌病(簡稱“布病”)是一種嚴重的人獸共患傳染病[1]，近些年其在我國北方地區的流行率呈逐年上升趨勢[2]。為了提高動物布魯氏菌病的診斷需求，新版國家標準《動物布魯氏菌病診斷技術》(GB/T 18646—2018)已于2018年9月開始執行，在原有診斷技術的基礎上，增加了間接酶聯免疫吸附試驗(iELISA)、競爭酶聯免疫吸附試驗(cELISA)及聚合酶鏈式反應(PCR)等血清學和病原學診斷新技術。由于ELISA方法具有靈敏性高、檢測通量大、人為因素影響小等優點，在近些年的布病檢測中得到了廣泛的研究和應用[3-4]。前人多有對虎紅平板凝集試驗(RBT)、試管凝集試驗(SAT)、ELISA等方法之間的符合率進行評價，但較少有對某種方法的產品間進行橫向對比的研究[5-7]。本試驗采用市面上流通的幾種iELISA及cELISA試劑盒，對采集的300份牛血清樣品進行了布病抗體檢測，比對這些試劑盒在臨床檢測中的應用情況。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 全疆各地采集的荷斯坦、西門塔爾及家養黃牛血清樣品共計300份。

1.2 試劑 布魯氏菌虎紅凝集試驗抗原及陰性、陽性對照血清，均購自英國APHA公司。檢測用試劑盒，均為市面購買，4種iELISA布病檢測試劑盒以編號A～D代表，5種cELISA布病抗體檢測試劑盒以編號E～I代表。

1.3 檢測方法 布魯氏菌病RBT和SAT操作方法及結果判定按照國家標準GB/T 18646進行。ELISA試驗步驟按試劑盒說明書操作。本試驗先用RBT和SAT試驗進行血清篩選，再用ELISA試劑盒進行比對試驗。

1.4 檢測結果一致性分析 根據Kappa計算方法，對4種iELISA試劑盒和5種cELISA試劑盒檢測結果進行結果一致性分析。Kappa值越高，表明兩種試劑盒的檢測結果一致性好;反之則表明一致性較差。

2 結果

2.1 RBT及SAT檢測結果 300份牛血清采用RBT初篩及SAT確診后，其中206份血清為布病抗體陽性，94份血清為布病抗體陰性。

2.2 iELISA試驗檢測結果 應用4種不同廠家生產的iELISA布病抗體檢測試劑盒(編號A～D)對篩選過的300份牛血清進行檢測，顯示其敏感性在97.9%～100.0%，特異性介于18.2%～27.3%，總體符合率在74.3%～77.1%，結果見表1。

表1 4種iELISA試劑盒檢測牛血清結果

2.3 cELISA試驗檢測結果 應用5種不同廠家生產的cELISA布病抗體檢測試劑盒(編號E～I)對300份牛血清進行檢測，顯示其對牛血清的檢測敏感性在95.8%～100.0%，特異性介于22.7%～81.8%，總體符合率在74.3%～92.9%。結果見表2。

表2 5種cELISA試劑盒牛血清檢測結果

2.4 一致性分析 同時用A、B、C、D這4種iELISA試劑盒和E、F、G、H、I這5種cELISA試劑盒對300份牛血清樣品進行檢測，其兩兩之間的Kappa 值見表3和表4。

表3 4種iELISA試劑盒兩兩比較的Kappa值

表4 5種cELISA試劑盒兩兩比較的Kappa值

3 討論

根據我國動物布魯氏菌病診斷技術國家標準，臨床血清學檢測時，一般選用RBT或iELISA方法進行初篩，用SAT或cELISA方法進行確診。RBT法具有敏感性高、耗時短、操作簡單等優點，但也存在交叉反應多、假陽性高等缺點。與SAT法聯用后，可提高早期感染診斷的準確率[8]。ELISA方法用于布病診斷已有多年的經驗，iELISA法對樣本要求量少，敏感性高，結果量化易于判斷，但也存在較高的假陽性率[9]；cELISA法因敏感性和特異性都較高，是一種很好的確診性試驗，在血清學檢測和奶樣檢測中均有應用[10-11]。

目前布病檢測所使用的各種檢測方法均有其優缺點[12-14]，其相對應的產品也存在一定的差異。本試驗采用RBT和SAT法對血清進行篩選后，挑選了市面上流通的4種iELISA和5種cELISA布病抗體檢測試劑盒，開展了牛血清布病抗體檢測比對試驗。對篩選后的牛血清開展檢測后發現，4種iELISA試劑盒表現出了良好的敏感性，均達到了95%以上的檢出率，但是其特異性均低于30%(18.2%～27.3%)。這個結果符合iELISA作為一種初篩試驗方法的定位，即盡量提高其敏感性，不出現漏檢的情況。4種產品與RBT和SAT確定的檢測結果總體符合率在75%左右(74.3%～77.1%)，與前人的檢測結果數據也基本保持一致[15]。5種cELISA試劑盒均有較好的敏感性(95.8%～100.0%)，在特異性上差異較大。作為一種確診的試驗方法，其特異性最高為81.8%，最低僅22.7%，顯示出產品之間存在較大的差異。

檢驗兩種檢測結果之間一致性的有效手段是進行Kappa檢驗，當Kappa>0.75時，表明2個結果高度一致；當Kappa值處于0.40～0.75時，表明結果一致性較為一般。4種iELISA檢測試劑盒，除了B試劑盒與C試劑盒之間檢測結果一致性稍低為0.707，其余3種iELISA試劑盒兩兩之間的檢測結果一致性均大于0.75(0.786～0.916)，表明4種試劑盒檢測結果高度一致，在用于布病血清學初篩時，可以任選其中一種即可。5種cELISA檢測試劑盒，兩兩之間的Kappa值分布在0.394～0.972，其中有5組試劑盒檢測結果之間的Kappa>0.75，表現出結果的高度一致性；4組試劑盒檢測結果之間的Kappa介于0.40～0.75，表明其檢測結果一致性一般；1組試劑盒檢測結果Kappa<0.40，表明其檢測結果之間的一致性較差。

血清學檢測是布魯氏菌病診斷過程中的重要手段，在檢測過程中，其差異性不僅存在于各方法之間，也存在于不同的產品之間。隨著新的國標方法的實施，ELISA作為一種高通量、易于定性的檢測方法，各種ELISA試劑盒產品將會大量的進入到市場當中，因此選擇合適的方法及產品，對提高布魯氏菌病的臨床診斷準確率具有重要意義。