1株羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定及毒素分型檢測

張疏桐，胡天豪，孫筱峰，陳思懷，張 耕，宋振輝，郭建華

(西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，重慶 榮昌 402460)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)舊稱魏氏梭菌，可引起人和動(dòng)物急性腹瀉、壞死性腸炎、腸道出血、氣性壞疽等疾病，是許多國家人和動(dòng)物食源性感染的重要病原[1-4]。該菌是一種革蘭陽性厭氧菌，菌體直桿狀，邊緣整齊，兩端鈍圓，大小為(0.6～2.4)μm×(1.3～19.0)μm，單在或成雙，短鏈，無鞭毛，不能運(yùn)動(dòng)，能產(chǎn)生莢膜并釋放毒素。在一般條件下罕見形成芽孢，在適宜的pH、溫度、合適比例的碳源等條件下才可形成芽孢。根據(jù)產(chǎn)生4種致死性毒素(α、β、ε、ι)的能力可將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為A、B、C、D和E五個(gè)毒素型，每個(gè)毒素型均能引起人或畜禽特定的疾病[5-6]。

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，產(chǎn)氣莢膜梭菌可引起羊只腹脹、腹瀉、食欲廢絕甚至突然死亡，感染病例剖檢可見心、肺、腎、胃腸道等多器官壞死、水腫或充血、出血等病變[7]。更為嚴(yán)重的是，該菌感染可引起膘情較好的羊急性死亡，且病死率超過40%[8]。因而，選擇合適的疫苗對(duì)防治羊產(chǎn)氣莢膜梭菌病顯得至關(guān)重要。

本試驗(yàn)通過對(duì)某黑山羊養(yǎng)殖場猝死羊進(jìn)行剖檢觀察，從1只小腸嚴(yán)重出血壞死的羊的回腸內(nèi)容物中分離得到1株溶血性厭氧致病菌，對(duì)該菌進(jìn)行培養(yǎng)特性觀察、生化試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)、小鼠致病性試驗(yàn)，16S rDNA PCR擴(kuò)增及測序、產(chǎn)氣莢膜梭菌毒力基因PCR試驗(yàn)，旨在鑒定該病原菌藥物敏感性、致病性和毒素分型，為該病防制及疫苗研究提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 病料 某黑山羊養(yǎng)殖場急性死亡羊只，腹部膨大，剖檢后發(fā)現(xiàn)回腸漿膜面嚴(yán)重出血，呈黑色，心包積液。無菌采集病死羊只出血腸段內(nèi)容物作為病原分離材料[9]。

1.2 菌種的分離培養(yǎng)及形態(tài)觀察 將病料劃線接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基，置于2.5 L厭氧培養(yǎng)袋中，37 ℃ 培養(yǎng)24 h[10]，挑取單菌落，于腦心浸出液肉湯(Brain heart infusion，BHI)厭氧培養(yǎng)基(5 mL BHI培養(yǎng)基+1 mL 液體石蠟)中37 ℃培養(yǎng)24 h，分別于6、12、18 h和24 h觀察培養(yǎng)基狀態(tài)并記錄，取37 ℃培養(yǎng)24 h的菌液25 μL進(jìn)行涂片，分別進(jìn)行革蘭染色、莢膜染色、芽孢染色和鏡檢。取BHI厭氧培養(yǎng)基中菌種，稀釋至約109CFU/mL(OD600=0.600)，吸取菌液500 μL，加入500 μL 60%無菌甘油，置于-40 ℃保存。

1.3 培養(yǎng)特性觀察 將1.2中厭氧培養(yǎng)基中的菌液稀釋至108CFU/mL，吸取200 μL，分別均勻涂布于20 mL LB瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂(Tryptic soy agar，TSA)培養(yǎng)基、巧克力瓊脂培養(yǎng)基、BHI瓊脂培養(yǎng)基上，分別置于2.5 L厭氧培養(yǎng)袋和有氧環(huán)境37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察生長情況。

1.4 生化特性鑒定 分離菌分別接種于葡萄糖、山梨醇、乳糖、棉子糖、明膠、側(cè)金盞花醇、衛(wèi)矛醇、枸櫞酸鹽等生化反應(yīng)管，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，進(jìn)行生化鑒定；牛乳發(fā)酵試驗(yàn)，觀察是否出現(xiàn)牛乳洶涌發(fā)酵現(xiàn)象[11]。

1.5 藥敏試驗(yàn) 吸取0.5麥?zhǔn)蠞舛染?00 μL，均勻涂布于TSA平板，待菌液吸收后，35 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后測量各藥物抑菌圈的大小(mm)，根據(jù)藥敏紙片說明書及抑菌圈直徑大小判斷分離菌株對(duì)各種藥物的敏感程度[12]。

1.6 16S rDNA的PCR擴(kuò)增 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的16S rDNA 通用引物進(jìn)行菌液PCR，反應(yīng)體系為50 μL：TaqPCR Master Mix(2×,Blue dye)25 μL，27F引物和1492R引物(10 μmol/mL，由重慶擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司合成)各1 μL，菌液(108CFU/mL)3 μL，ddH2O補(bǔ)至50 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃ 保溫[13]。

1.7 毒力基因檢測 根據(jù)文獻(xiàn)[14-15]合成plc、cpb、cpe、iap、etx、netB基因的引物(表2)，分別檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌α、β、ε、ι毒素、腸毒素和壞死性腸炎毒素B[14-15]。反應(yīng)體系為25 μL：TaqPCR Master Mix(2×,Blue dye)12.5 μL，上下游引物(10 μmol/mL，由重慶擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司合成)各2 μL，菌懸液2 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保溫[15]。

表1 產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因及其引物

1.8 致病性試驗(yàn) 將20日齡清潔級(jí)昆明小鼠分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，其中試驗(yàn)組分為兩組，每組5只小鼠，試驗(yàn)組的小鼠分別腹腔注射106、108CFU/mL 的分離菌，0.5 mL/只(即5×105CFU組和5×107CFU 組)；對(duì)照組的小鼠分別腹腔注射0.5 mL無菌BHI液體培養(yǎng)基。注射后每1 h觀察并記錄1次結(jié)果，觀察小鼠死亡時(shí)間；若24 h后，小鼠仍未死亡，則將5×105CFU 組菌液濃度提高至109CFU/mL，繼續(xù)腹腔注射0.5 mL/只(即5×108CFU 組)，試驗(yàn)結(jié)束將各組小鼠進(jìn)行剖檢，無菌分離腹水劃線接種TSA培養(yǎng)基進(jìn)行病原鑒定[13]。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌生長狀況及形態(tài)

2.1.1 細(xì)菌生長狀況 細(xì)菌在鮮血瓊脂平板上生長良好，呈光滑、灰白色、半透明、微凸起菌落，直徑約5 mm，有明顯的β溶血現(xiàn)象；液體培養(yǎng)基生長6 h時(shí)，培養(yǎng)液未渾濁；12 h時(shí)培養(yǎng)液開始出現(xiàn)渾濁，但無明顯產(chǎn)氣；18 h時(shí)培養(yǎng)液渾濁，有小氣泡產(chǎn)生；24 h 時(shí)培養(yǎng)液渾濁，產(chǎn)生大量氣體。

2.1.2 鏡檢形態(tài) 革蘭染色可見革蘭陽性、短棒狀、兩極著染桿菌；孔雀石綠-番紅染色未見明顯芽孢結(jié)構(gòu)，莢膜染色可見清晰莢膜。

2.1.3 培養(yǎng)特性 有氧條件下，該菌在5種培養(yǎng)基上均不生長；厭氧培養(yǎng)袋中，該菌在BHI瓊脂、TSA和鮮血瓊脂3種培養(yǎng)基上均生長良好，在LB瓊脂上生長較差，在麥康凱瓊脂上不生長。

2.2 16S rDNA的PCR與序列分析 將16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物送至重慶擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果在GenBank上進(jìn)行BLAST比對(duì)，與云南昆明分離得到的編號(hào)為MK156683.1(KM-1株)的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌同源性達(dá)到99%。

2.3 生化試驗(yàn) 發(fā)酵葡萄糖、乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不發(fā)酵衛(wèi)矛醇、山梨醇、側(cè)金盞花醇和棉子糖，明膠試驗(yàn)、MR試驗(yàn)陽性，V-P、靛基質(zhì)、枸櫞酸鹽利用、H2S試驗(yàn)均為陰性，脲酶試驗(yàn)可疑，石蕊牛乳培養(yǎng)基出現(xiàn)該菌特有的“爆裂發(fā)酵”現(xiàn)象(表2)。

表2 分離株生化試驗(yàn)結(jié)果

2.4 藥敏試驗(yàn) 經(jīng)藥敏試驗(yàn)證實(shí)，該分離菌株對(duì)阿米卡星、卡那霉素、慶大霉素等氨基糖苷類抗生素及多黏菌素B、復(fù)方新諾明耐藥，對(duì)紅霉素中度敏感，對(duì)其他抗生素高度敏感(表3)。

表3 分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.5 毒素基因的擴(kuò)增 如圖1所示，僅擴(kuò)增得到α毒素基因plc。

圖1 毒素基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.6 致病性試驗(yàn) 24 h時(shí)，對(duì)照組、5×105CFU組和5×107CFU組小鼠均不死亡，但5×107CFU組小鼠精神沉郁、食欲減退，將菌液量濃度提高至5×108CFU時(shí)，小鼠6 h全部死亡。剖檢發(fā)現(xiàn)5×107CFU 組和5×108CFU組小鼠空腸、回腸均有出血現(xiàn)象，5×108CFU組鼠腸道嚴(yán)重出血，且兩組小鼠腹水中均分離得到該菌。

3 討論

根據(jù)文獻(xiàn)[17]可知，自1892年首先從人腐敗尸體膨脹產(chǎn)氣的血管中第1次分離得到產(chǎn)氣莢膜梭菌起，產(chǎn)氣莢膜梭菌的研究就從未停止過。研究表明，產(chǎn)氣莢膜梭菌可引起人和動(dòng)物氣性壞疽、壞死性腸炎、食物中毒、腸毒血癥等嚴(yán)重的傳染性疾病，是一類非常重要的人獸共患病病原，關(guān)系著生物安全和食品安全。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)于產(chǎn)氣莢膜梭菌分子病原學(xué)方面的研究也日趨成熟，不僅有多重PCR對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行毒素分型的研究[18]，也有對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌基因工程疫苗的研究[19]。再加之產(chǎn)氣莢膜梭菌病具有病死率高、病程極短、感染動(dòng)物種類多等特點(diǎn)，因此，對(duì)其防制方面的研究顯得尤為重要。

本試驗(yàn)從生產(chǎn)實(shí)際出發(fā)，對(duì)某黑山羊場壞死性腸炎死亡羊只進(jìn)行腸內(nèi)容物細(xì)菌分離培養(yǎng)，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定、16S rDNA測序、生化試驗(yàn)、毒力基因PCR檢測證實(shí)該分離菌株為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌。致病性試驗(yàn)證實(shí)小鼠致死量5×107～5×108CFU。經(jīng)藥敏試驗(yàn)顯示，該菌株對(duì)氨基糖苷類抗生素有較強(qiáng)的耐藥性，但對(duì)其他抗生素較敏感。后續(xù)的研究中，將對(duì)該分離菌株進(jìn)行plc基因全序列擴(kuò)增及測序，并對(duì)其進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)分析，觀察其是否存在堿基位點(diǎn)突變及突變對(duì)其毒力的影響。

結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果，建議該黑山羊養(yǎng)殖場對(duì)環(huán)境進(jìn)行全面消毒，對(duì)已發(fā)病羊只可注射氨芐西林、青霉素鉀等藥物進(jìn)行治療，并適當(dāng)補(bǔ)液；對(duì)未發(fā)病羊只，可緊急接種A型產(chǎn)氣莢膜梭菌滅活疫苗進(jìn)行預(yù)防，以免此病的流行。