弓形蟲分泌蛋白轉運機制的研究進展

李 爽，劉 群

(中國農業大學動物醫學院 國家動物寄生原蟲實驗室，北京 海淀 100193)

弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種重要的人獸共患機會性病原，專性細胞內寄生，幾乎感染所有的溫血動物及人類，危害嚴重。弓形蟲在中間宿主體內主要有2種存在形式，即速殖子和緩殖子，緩殖子外被囊壁，以包囊形式存在[1]。速殖子的入侵、增殖和逸出是弓形蟲傳播必不可少的過程，任何一個步驟出現異常都不能使其正常寄生。

弓形蟲的順利入侵、增殖和逸出主要依賴于其3種獨特的分泌細胞器，即微線體、棒狀體和致密顆粒。蟲體入侵時，首先產生微線體蛋白(Microneme proteins，MICs)和棒狀體頸部蛋白(Rhoptry neck proteins，RONs)將弓形蟲錨定在宿主細胞膜上，隨后穿過細胞膜進入宿主細胞，釋放棒狀體蛋白(Rhoptry proteins，ROPs)和致密顆粒蛋白(Dense granular proteins,GRAs)，形成納蟲空泡(Parasitophorous vacuole，PV)。ROPs可調控宿主細胞的免疫應答促使宿主細胞提供有利環境維持自身增殖和生存；部分GRAs被分泌到PV參與形成納米微管-囊泡網絡，攝入生長必需養分并調控自身抗原的暴露，也可以分泌到宿主細胞，調節宿主基因表達，觸發宿主免疫反應[2]。

這些分泌蛋白是維持蟲體正常生命活動和傳播的必要分子，其中有些是弓形蟲重要的毒力因子，因此闡明弓形蟲分泌細胞器從頭合成的分子機制和分泌蛋白加工轉運途徑是近數十年來的研究熱點，加上最近開發的眾多分子生物學研究手段，促進了弓形蟲作為頂復門原蟲蛋白質運輸和細胞器生物發生模型的研究。因此，本文將對分泌蛋白的合成、分類和運輸的研究進展做一綜述。

游客們對三峽地區歷史文化的認知主要是巴蜀文化和巫文化。原始的巴人部落、舞蹈表演和神秘的巫文化祭祀活動構成了游客們對三峽地區古代文明的體驗，幫助游客更好地理解遙遠的歷史文化。一位廣西的年輕游客描述了印象深刻的巫文化祭祀表演：

1 弓形蟲分泌系統亞細胞結構

弓形蟲具有一個內質網(Endoplasmic reticulum,ER)與核膜相連。高爾基體(Golgi)由3～5個折疊的腔室堆積而成，向外分泌延伸[3]。分泌蛋白在核糖體合成后有序的從內質網運輸到高爾基體，再從高爾基體流向內體樣的腔室，包括早期內體(Early endosome,EE)和晚期內體(Late endosome,LE)，經過蛋白酶水解修飾，形成棒狀體和微線體的前體蛋白[4]。弓形蟲的LE附近還存在一個充滿大量蛋白酶的植物樣液泡(Plant-like vacuole，PLV)[5],其中組織蛋白酶L(Cathepsin L,CPL)介導了微線前體蛋白的水解成熟。這些現象表明，弓形蟲具有獨特的內體系統(Endosomal-like compartments,ELC)，與弓形蟲增殖過程中頂端分泌細胞器的生物發生和蛋白功能的發揮直接相關。

2.4 兩組患者術后排尿情況比較 術后6個月研究組患者排尿潴留、排尿困難、尿失禁、尿急及尿頻的發生率均顯著低于對照組患者，差異有統計學意義(χ2=7.350，P<0.05)。見表5。

2 弓形蟲分泌蛋白的生物合成

除了這些分泌蛋白自身的保守基序和結構域在蛋白轉運過程中起作用外，還有很多調控因子發揮著核心功能。目前，鑒定出部分弓形蟲蛋白分泌過程中囊泡出芽、運輸和融合機制的相關因子。主要包括以下幾種。

Rab蛋白：Rabs是最大的小G蛋白家族，在囊泡運輸中起分子開關作用，是囊泡從供體到受體定向運輸所必需的[18]。弓形蟲只存在一組基本的Rab蛋白，TgRab5A定位于EE，Rab5A和Rab5C過表達導致微線體和棒狀體轉運缺陷，ROPs被重新運輸到PV中。此外，過表達TgRab11A或TgRab11B都可以導致蟲體分裂異常，新合成的內膜復合體(Inner membrane complex,IMC)從高爾基體向子代細胞的運輸和分泌受阻，表明TgRab11A和TgRab11B調節組成性分泌[19]。

2.3 致密顆粒蛋白 致密顆粒為球形致密細胞器，直徑約200 nm，不同感染階段蟲體中的致密顆粒數量不同[16]。

2.2 棒狀體蛋白 棒狀體的位置與微線體幾乎一致[10]，共有8～12個，其生物合成由高爾基體的囊泡出芽驅動，在TGN和正在分裂的蟲體頂端之間形成大的囊泡，不斷發育成熟[11]，但其成熟途徑和機制尚不完全清楚。

ROPs的分選機制與MICs非常相似，可溶性ROPs可攜帶多種不同的靶向信號[12]。ROP2和ROP4都具有一個跨膜結構域，基于酪氨酸的分選信號(YXXΦ基序)有助于將蛋白質分類到棒狀體[13]。任何一個基序發生缺失或突變都會阻斷蛋白向成熟棒狀體的轉運，導致它們在類似多泡體(Multivesicular bodies，MVB)的大囊泡中積累[14]。這些數據表明，ROPs從TGN到早期內體可能以復合物的形式運輸，依賴于不同蛋白的分類信號。事實上，后來鑒定TgSORTLR是ROPs轉運的關鍵受體，條件性敲除后導致蛋白定位錯誤，成熟異常[15]。

本文以理論計算和數值模擬相結合的方法，得出CFG樁復合地基的公式計算沉降量和有限元分析結果相符。首先對CFG樁復合地基的承載性狀進行了理論研究，再利用MIDAS有限元軟件，分析了褥墊層厚度、置換率對樁復合地基的承載特性的影響。主要結論如下：

吳湞長時間在江西省衛生系統工作。他曾任江西省衛生廳醫教科技處干部；1989年-2000年，任江西省衛生廳藥政管理局副局長、局長。

綜上所述，我們在組織銜接教學時，一定要把握住學生學習過程中所暴露的問題，要針對性地給出解決方案，這樣才能讓我們的教學更有效率.

3 弓形蟲蛋白分泌轉運的關鍵因子

2.1 微線體蛋白 微線體位于弓形蟲頂部100～150 μm的位置，表達多種MICs，在分泌途徑早期組裝成復合體，不同蛋白之間的相互作用是它們從反式高爾基體網(Trans-golgi network,TGN)靶向到微線體的必要手段[6]。

GRAs與形成宿主細胞器隔離管狀結構(Host organelle sequestering tubular structures H.O.S.T.)和膜狀納米管腔網絡結構(Membranous nanotubular intravacuolar network，IVN)有關，前者調節宿主內體和溶酶體向PV的傳遞，后者連接PV內的蟲體和PV膜[17]。與高等生物的真核細胞不同，弓形蟲中從未觀察到未成熟的致密顆粒。目前發現引起GRAs轉運異常的蛋白還很少，并且新合成的GRAs從TGN轉運到致密顆粒的分子機制目前尚不清楚，需要更多的研究來闡明其分泌途徑。

TgMIC6是一種跨膜蛋白，也是TgMIC4和TgMIC1的轉運蛋白，這種聯系通過MIC6的特征性生長表皮因子(Epidermal growth factor,EGF)樣結構域介導[7]，與TgMIC1的類半乳糖凝集素結構域(Galactose-like agglutinin domain)相互作用，其中SYHYY和EIEYE兩個酪氨酸的基序可以對該復合物進行正確的分類[8]。TgMIC2與TgM2AP在弓形蟲表面以復合物的形式分泌，有助于滑移運動和對宿主細胞附著。M2AP前肽發揮分類作用，決定了分泌蛋白的靶向性[9]。復合物的每個組成部分都具有不同的分類信號，它們分泌方式和功能的差異直接與分泌細胞器生物合成過程中的不同轉運途徑有關，但這些不同的MICs是否依賴于不同的分類機制仍有待確定。

可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體蛋白(SNAREs)：定位于內體系統(ELC)和高爾基體(Golgi)之間，促進囊泡融合傳遞貨物蛋白。3種突觸蛋白synaptobrevin/VAMP、syntaxin和SNAP-25形成復合物共同構成突觸小泡與質膜融合機制的核心[20]。弓形蟲存在23種SNARE樣蛋白，其中Stx6定位于TGN、Golgi和ELC之間以及蟲體表面。過表達后蟲體發育畸形，ELC擴張，Golgi破碎，IMC成熟異常，并破壞蛋白從ELC到高爾基體的運輸[21]。

網格蛋白銜接復合物(Clathrin adaptor complexes)：在真核細胞中有6種AP復合物，功能不同[22]。AP-1在TGN到內體的順行和逆行中起作用，破壞TgAP1 μ1亞基導致MICs在TGN水平上的分類錯誤，使可溶性MIC3重新進入PV，而跨膜MIC8主要保留在TGN中。此外，TgAP1可以通過激活TGN中的ROPs轉運來調節棒狀體的生物發生，缺失TgAPμ1導致成熟的棒狀體破碎，未成熟的ROPs被重新運輸到PV或殘體中[23]。因此，TgAP1可能在pro-ROP從TGN中運出的過程和未成熟棒狀體向成熟棒狀體的轉變過程中發揮作用[24]。

囊泡分選蛋白(Vacuole protein sorting,VPS)：酵母和哺乳動物細胞中，內溶酶體系統包含2個同源的系留復合體：內體Class C core vacuole/endosome tethering(CORVET)和Homotypic fusion and vacuole protein sorting(vacuolar HOPS)，這些復合物對于內體從早期到晚期的轉變、溶酶體生物發生和內溶酶體運輸途徑至關重要[25]。TgSORTLR也稱VPS10，定位于高爾基體-內體相關區室內，具有2個關鍵的結構域。N末端TgSORTLR內腔結構域與ROPs和MICs特異性相互作用，異位表達導致自身蛋白以及棒狀體和微線體蛋白均定位錯誤；而胞質尾部結構域則參與蛋白質的順行和逆行運輸。因此，TgSORTLR是弓形蟲分泌細胞器生物發生和蛋白轉運的關鍵。TgVps11是 HOPS和CORVET裝配的支架蛋白，與囊泡和未成熟分泌細胞器有關[15]。隨后，研究人員在弓形蟲中又發現了多個VPS蛋白，包括VPS4、VPS18、VPS39和VPS9等，它們均參與調節分泌細胞器的生物發生[26]。

動力蛋白相關蛋白B(Dynamin-related protein，DrpB)：動力蛋白是一種大的GTPase，通過充當機械酶來切斷囊泡之間的聯系，參與細胞器分裂或囊泡運輸[27]。弓形蟲中存在3個動力相關蛋白，分別是DrpA、DrpB和DrpC，其中TgDrpB定位在Golgi附近，通過調節分泌途徑中的囊泡運輸促進分泌細胞器的形成，條件性敲除DrpB導致成熟的子代蟲體微線體和棒狀體丟失[28]。

4 展望

弓形蟲利用其內體系統發揮分泌轉運蛋白的功能，使MICs和ROPs高效有序的沿著TGN到ELC的路線通向頂端分泌細胞器，其中多種蛋白因子參與調控，從而確保蛋白精確無誤的靶向運輸。HOPS復合體參與了分泌蛋白從TGN到未成熟細胞器的順行運輸和融合，Vps10與AP-1、AP-2、網格蛋白、Vps9和逆轉錄酶復合物結合，是貨物蛋白順行和逆行轉運的關鍵受體(圖1)。然而，現在還需要更多的研究來證明弓形蟲早期內體向晚期內體的轉化機制，分泌囊泡的分類途徑，以及參與分泌蛋白轉運成熟的相關蛋白及其作用機制。此外，GRA蛋白對弓形蟲的毒力和生存至關重要，調節致密顆粒生物發生和蛋白分泌的機制仍然是弓形蟲分泌蛋白研究的重點難點，還未有探索。因此，對于揭示弓形蟲分泌蛋白的運輸成熟仍需大量研究。

圖1 弓形蟲分泌蛋白轉運模式