毛蕊花糖苷對熱損傷睪丸間質細胞凋亡的保護作用

陳 雪，王 鶯，康 晶，賴增妍，鄭連文 , 趙東海

(1.吉林醫藥學院基礎醫學院，吉林 吉林 132013；2.吉林醫藥學院臨床醫學院，吉林 吉林 132013；3.吉林大學第二醫院，吉林 長春 130041)

因生活習慣改變，如久坐、缺乏運動等，會使男性睪丸處于高溫環境中，進而導致氧化應激損傷發生。有報道稱，小鼠在熱應激損傷后，不僅睪丸組織受到損害，而且精子質量也會發生異常，導致生殖功能低下[1]。

毛蕊花糖苷是中藥肉蓯蓉的有效成分[2]。有研究表明，毛蕊花糖苷可改善小鼠睪丸萎縮和雄激素減少，減少勃起潛伏期和增加精子數量[3]。目前，有關毛蕊花糖苷在雄性生殖功能改善的研究尚不深入，相關的作用機理仍不清晰。本試驗通過制備熱應激損傷睪丸間質細胞(TM3)模型，觀察毛蕊花糖苷對TM3熱應激損傷的保護作用和機制，從而為毛蕊花糖苷在雄性生殖損傷保護中的開發和應用提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 F12培養液、胎牛血清、青霉素、鏈霉素，美國Sigma 公司；總蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒，碧云天生物科技有限公司；兔抗人Bax多克隆抗體、兔抗人Bcl-2多克隆抗體、兔抗人Cleaved-caspase 3多克隆抗體,美國Cell Signal公司；Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒，江蘇凱基生物公司。

1.2 主要儀器 倒置光學顯微鏡(奧林巴斯)；高速低溫離心機(德國Ependoff公司)；電泳儀、電轉移儀、垂直電泳槽(美國BioRad 公司)；CO2培養箱、旋渦震蕩儀(美國Thermo公司)。

1.3 試驗對象 細胞株TM3，購自中國科學院細胞庫。

1.4 試驗方法

1.4.1 試驗設計 TM3用含1%雙抗、10%胎牛血清的F12培養液培養，置于5% CO2、飽和濕度、37 ℃ 培養箱中。定期換液，并根據生長情況傳代。試驗分為6組：正常對照組、熱損傷模型組、毛蕊花糖苷低、中、高劑量組和陽性對照組。根據預試驗結果以及參考文獻[4]方法，TM3置于5% CO2、飽和濕度、40 ℃培養箱中制備熱應激損傷TM3細胞模型。將對數生長期TM3消化后，以1×105個/mL的濃度接種于96孔板中。培養24 h后，熱損傷模型組、毛蕊花糖苷組和陽性對照組TM3移至5% CO2、40 ℃培養箱。其中，毛蕊花糖苷低、中、高劑量組分別加入終濃度為25、50 μg/mL和100 μg/mL的毛蕊花糖苷。根據參考文獻[5]，陽性對照組加入終濃度為50 IU/mL的維生素C，每組設3個復孔。

1.4.2 MTT法測定各組TM3存活率 各試驗組細胞培養4 h后,加入終濃度0.5 μg/mL的MTT繼續培養4 h。吸取上清液，加入150 μL DMSO，振蕩混勻10 min后使用酶標儀測定490 nm處吸光度值(A)。假設正常對照組細胞全部存活，計算其余各組存活率。細胞存活率=(試驗組平均A值/對照組平均A值)×100%。

1.4.3 Annexin V/PI檢測細胞凋亡 用不含EDTA的胰酶消化對數生長期的細胞，洗滌離心后加入100 μL 1×Binding buffer重懸。加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI染色液混勻，避光室溫反應10～15 min。加400 μL 1×Binding buffer，混勻置于冰上，1 h內用流式細胞儀檢測。用Cell Quest軟件進行分析，以FITC為橫坐標，PI為縱坐標，繪制散點圖。

1.4.4 Western Blot法測定TM3凋亡相關蛋白基因Caspase-3、Bax與Bcl-2的表達 收集各組TM3，用預冷的PBS清洗，加入RIPA裂解液，超聲3%功率，冰上裂解5 min后，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，收集上清液，BCA法測定蛋白濃度，用溴酚藍和裂解液將蛋白調整成等濃度后，煮沸10 min，變性后的蛋白經SDS-PAGE電泳分離后，濕轉2 h到PVDF膜上，TBST配制的5%(體積分數)脫脂奶粉室溫封閉1 h，然后將PVDF膜與經TBST稀釋的一抗(Caspase-3 1∶1 000、Bax 1∶500、Bcl-2 1∶500)4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次，每次10 min后加入1∶5 000 的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min，洗膜3次后，ECL化學發光試劑盒顯色，進行拍照及灰度值分析。

2 結果

2.1 毛蕊花糖苷與熱應激損傷TM3存活率 與正常對照組比較，熱損傷模型組部分細胞變圓，部分細胞脫落懸浮于培養液中，細胞存活率降低(P<0.01)。不同劑量毛蕊花糖苷作用4 h后，與模型組相比，低劑量組細胞存活率升高(P<0.05);中、高劑量組細胞存活率顯著升高(P<0.01)，且呈濃度依賴性。毛蕊花糖苷高劑量組細胞存活率與陽性對照組相近(P>0.05)。見圖1。

圖1 毛蕊花糖苷對熱應激損傷TM3存活率的影響

2.2 毛蕊花糖苷與熱應激損傷TM3凋亡率 正常對照組、模型組、毛蕊花糖苷低、中、高劑量組和陽性對照組的總凋亡率分別為(8.27±0.35)%、(30.33±0.81)%、(24.31±1.02)%、(18.23±0.64)%、(11.26±0.17)%和(10.43±0.53)%。本試驗中熱損傷4 h后，模型組TM3凋亡率與正常對照組比較明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，不同劑量毛蕊花糖苷作用4 h后，低劑量組TM3凋亡率降低(P<0.05)；中劑量組和高劑量組TM3凋亡率明顯降低(P<0.01)，且呈濃度依賴性；陽性藥物組細胞凋亡率明顯低于模型組(P<0.01)。見圖2。

圖2 毛蕊花糖苷對熱應激損傷TM3凋亡的影響

2.3 毛蕊花糖苷與熱應激損傷TM3的Cleaved-caspase 3、Bcl-2和Bax蛋白表達 如圖3和圖4所示，與正常對照組比較，熱損傷模型組TM3的Bcl-2蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)，Cleaved-caspase 3和Bax蛋白表達水平明顯升高(P<0.01),Bax/Bcl-2比值明顯升高(P<0.01)。與熱損傷模型組相比，不同劑量毛蕊花糖苷作用4 h后，低劑量組TM3 Bcl-2蛋白表達水平明顯增高(P<0.05)，Cleaved-caspase 3、Bax蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，Bax/Bcl-2比值降低(P<0.05)；中劑量組和高劑量組Bcl-2蛋白表達水平明顯增高(P<0.01)，Cleaved-caspase 3、Bax蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)，Bax/Bcl-2比值降低(P<0.01)，蛋白表達水平變化呈濃度依賴性。陽性藥物組與模型組相比，Bcl-2蛋白表達水平明顯增高(P<0.01)，Cleaved-caspase 3、Bax蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)，Bax/Bcl-2比值明顯降低(P<0.01)。

圖3 毛蕊花糖苷對熱應激損傷TM3 Cleaved-caspase 3、Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

圖4 毛蕊花糖苷對熱應激損傷TM3 Cleaved-caspase 3、Bcl-2和Bax蛋白相對表達的影響

3 討論

研究表明，睪丸長期處于高溫狀態的男性可出現生育力下降，主要表現為精子質量異常及不成熟精子比例增高[6-8]。目前，有多種途徑促使小鼠睪丸受到熱應激，如讓小鼠睪丸置于高溫水中、利用手術制造隱睪癥和高溫狀態下飼養小鼠等，同時這些研究也證實睪丸受到熱應激后會導致生育力下降[9-11]。毛蕊花糖苷是黃酮類的苯丙素糖苷單體，分子式為C29H36O15,分子量624.59，廣泛存在于中草藥植物中，在列當科植物肉蓯蓉的肉質莖中含量較高。研究表明，毛蕊花糖苷具有多種藥理活性，具有抗氧化[12]、肝保護[13]、抗炎和鎮痛活性等[14]。本試驗結果發現，經毛蕊花糖苷處理后，可使熱損傷TM3存活率升高，凋亡率降低，并呈現劑量依賴關系。

細胞凋亡是細胞生長增殖過程中重要的調節方式，是由基因調控的主動死亡，可清除衰老、破損及具有潛在危險的細胞[15]。生精細胞的凋亡可以維持精子發生的動態平衡，保證成熟精子的數量和質量。有報道稱，在男性不育的致病因素中，凋亡可能起著重要的作用[16-17],可能引起特發性少精、弱精、畸形精子癥等[18-19]。一些學者還發現，男性不育及精子異常都與一些自發或化學因素誘發的凋亡過程密切相關[20-21]。

細胞凋亡的信號通路主要分為細胞表面死亡受體途徑及線粒體凋亡通路[22-23]。Bcl-2家族蛋白是調控線粒體凋亡通路的關鍵因子[24]。其中，Bcl-2 是Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白,而Bax 是凋亡蛋白,二者可通過改變線粒體形態及外膜的通透性，影響膜間隙蛋白釋放及Caspase級聯活化調控細胞的凋亡[25]。細胞受到損傷刺激后，Bax 蛋白大量表達,導致線粒體膜通透性加強，細胞凋亡誘導因子(AIF)進入細胞質，激活Caspase 3 級聯反應，激發細胞凋亡[26]。

熱損傷可以導致位于線粒體和內質網的Bax 累積，當線粒體膜上的Bcl磷酸化失活后，逐漸累積的Bax會使線粒體釋放出大量的細胞色素C，導致以Caspase 3為代表的凋亡蛋白家族的激活，最終導致細胞凋亡[27]。本試驗結果顯示，毛蕊花糖苷應用于熱損傷TM3后，Bcl-2活性明顯增高，Cleaved-caspase 3、Bax活性明顯降低，Bax/Bcl-2比值降低，且呈濃度依賴性。表明毛蕊花糖苷可能通過抑制Caspase 3、Bax/Bcl-2信號通路實現抗凋亡作用。

綜上所述，毛蕊花糖苷能夠促進熱損傷TM3增殖，降低熱損傷TM3凋亡發生，其作用機制可能與毛蕊花糖苷通過調控Caspase 3、Bax/Bcl-2蛋白信號通路抑制凋亡的發生有關。本試驗結果為男性不育的藥物治療提供了新思路,為研究毛蕊花糖苷的生精作用提供了科學依據。