斑馬副蛔蟲線粒體cox1和nad5基因序列多態性

賀名葉，謝 旖，田世成，張卓億，劉 偉

(1.湖南省益陽職業技術學院，湖南 益陽 413055；2.湖南農業大學動物醫學院，湖南 長沙 410128)

馬副蛔蟲(Parascarisequorum,P.equorum)和Parascarisunivalens是已知寄生于馬腸道內最大的線蟲，其感染均可導致宿主生長緩慢、腹瀉、貧血等，嚴重時宿主因腸梗塞而死亡[1]。長期以來，國內外許多學者根據馬副蛔蟲和Parascarisunivalens的形態學特征、基因組特征和生理生化等特點對其進行比較，得到的結果存在較大差異，導致這兩種線蟲是否為同一個種存在較大的爭議[2-5]，如Nielsen等[4]調查結果認為兩者為不同種，因為其染色體數目存在差異；而Gao等[3]以線粒體全基因序列分析馬副蛔蟲與P.univalens之間同源性，發現兩者線粒體全基因組核苷酸序列同源性達99.1%～99.9%，提示馬副蛔蟲與P.univalens為異名同種。

對寄生蟲進行治療或進一步研究的前提是對其進行準確鑒定，但馬屬動物可感染兩種大型蛔蟲，分別為馬副蛔蟲和Parascarisunivalens，兩者之間形態學特征差異小，導致傳統的形態學鑒定手段有一定的局限性。線粒體DNA具有進化速度快和母系遺傳等特征，利用線粒體DNA(或部分基因序列)作為分子標記應用于馬屬蛔蟲的分類鑒定和遺傳進化等研究十分常見[3-5]。本試驗采用PCR對斑馬糞便中獲得的9株蛔蟲樣品的線粒體細胞色素基因部分序列I(pcox1)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶第5亞基基因部分序列(pnad5)進行擴增，分析其基因序列的同源性及遺傳進化關系，為斑馬源蛔蟲的分子鑒定和分子流行學等研究提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 蟲株來源 2017年長沙市生態野生動物園對園區內部分草食動物進行藥物驅蟲，先后在9匹斑馬糞便中發現線蟲，形態學初步鑒定為蛔蟲屬，用滅菌PBS清洗后分別標記，保存于-20 ℃。

1.2 主要試劑 組織DNA提取試劑盒，購自美國賽默飛公司；蛋白酶K，購自德國Merck公司；PCR試劑和DL-2 000 DNA marker，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 線粒體pcox1與pnad5基因擴增與測序 根據參考文獻[6-7]設計擴增蛔蟲線粒體pcox1和pnad5基因序列的引物序列：pcox1-F：5′-TTAGTT-TCTTTTCCTCCGCT-3′，pcox1-R：5′-TAAAGAAAGA-ACATAATGAAAATG-3′；pnad5-F：5′-TAG AGGGG-CTATGAATACTG-3′，pnad5-R：5′-ACGGCCATCTTGTTGACCTAATG-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

將蟲體反復清洗，剪取約1.5 cm蟲體按照組織DNA提取試劑盒說明書提取蟲體核酸DNA，保存于-80 ℃。以基因組DNA為模板分別擴增線粒體pcox1和pnad5基因序列，PCR擴增體系(50 μL)：PCR Mix 25 μL、上下游引物 2 μL(10 pmol/L)、模板DNA 4 μL和滅菌蒸餾水17 μL。擴增條件:94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環；72 ℃ 10 min。PCR產物經1.2%凝膠電泳檢測并由長沙擎科生物科技有限公司測序。

1.4 線粒體pcox1和pnad5基因序列分析 應用DNASTAR軟件對獲得的序列進行拼接，從GenBank下載具有代表性的蛔目線粒體cox1和nad5基因序列，利用MegAlign軟件分析斑馬蛔蟲pcox1、pnad5序列與其他蛔蟲分離株對應核苷酸序列同源性；應用DnaSP 5.0軟件分析序列核苷酸多樣性(Pi)、單倍型多樣性(Hd)、單倍型數(H)、平均核苷酸差異(K)等特性；以旋毛蟲(Trichinellaspiralis)作為外群，采用K2P模型，利用MEGA 7.0軟件中鄰接法(Neighbor joining，NJ)構建種系發育樹，并重復1 000次 自舉檢驗(Bootstrap test)。

2 結果

2.1 PCR擴增 本試驗中9個斑馬蛔蟲樣品(樣品編號為BM1～9)均擴增出約450 bp和528 bp的基因片段，與預期線粒體pcox1和pnad5基因序列大小相符(圖1)，表明分別擴增出斑馬蛔蟲線粒體pcox1和pnad5序列。

圖1 斑馬蛔蟲線粒體pcox1(A)與pnad 5(B)基因序列的PCR擴增結果

2.2 斑馬源蛔蟲線粒體pcox1和pnad5基因序列特征與同源性分析 將斑馬蛔蟲線粒體pcox1和pnad5基因序列的測序結果經校正并剔除多余序列后，9個斑馬蛔蟲分離株擴增的線粒體pcox1和pnad5基因序列長度分別為422 bp和528 bp，占cox1和nad5基因序列全長的26.74%(422/1 578)和33.31%(528/1 585)，未檢測到核苷酸插入或缺失，序列中A+T平均含量分別為62.32%(263/422)和65.15%(344/528)。

同源性分析結果顯示，本試驗中9個斑馬蛔蟲樣品線粒體pcox1和pnad5基因序列之間的同源性分別為99.3%～100.0%和98.1%～99.5%，與GenBank中登錄的馬副蛔蟲分離株(MK209654.1和MK209665.1)同源基因序列相似性分別為99.5%～100.0%(pcox1)和97.6%～99.8%(pnad5)，與P.univalens分離株(KM067271.1)同源基因序列相似性分別為99.2%～100.0%(pcox1)和97.9%～99.3%(pnad5)，與其他蛔蟲同源基因序列相似性均低于92.0%(pcox1)和91.2%(pnad5)。

2.3 斑馬源蛔蟲線粒體pcox1和pnad5基因序列遺傳多樣性分析 9個斑馬源蛔蟲樣品線粒體pcox1基因序列檢測出6個單倍型，共含有8個可變位點，其總單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)分別為0.624和0.004 37，平均核苷酸差異(K)為1.834；而pnad5基因序列檢測出8個單倍型，共含有14個可變位點，其總單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)分別為1.000和0.009 67，平均核苷酸差異(K)為4.071。結果表明斑馬蛔蟲線粒體pcox1基因序列變異程度較pnad5基因低(表1)。

表1 基于線粒體pcox1和pnad 5基因序列分析斑馬源蛔蟲遺傳多樣性

2.4 斑馬源蛔蟲線粒體pcox1和pnad5基因序列系統發育分析 將斑馬源蛔蟲線粒體pcox1序列(422 bp)和pnad5序列(528 bp)串聯，利用MEGA 7.0軟件中NJ法構建系統發育樹。結果顯示，9個斑馬源蛔蟲分離株與已知馬副蛔蟲分離株(MK209654和MK209665)、P.univalens分離株聚為同一分支，貝氏蛔蟲屬(Baylisascarisspp.)聚為另外一個分支，馬副蛔蟲和P.univalens與貝氏蛔蟲屬所屬分支相距較近，但與其他蛔蟲所屬分支相距較遠(圖2)，但本次試驗所構建的系統進化樹無法區分馬副蛔蟲和P.univalens。

圖2 斑馬蛔蟲與其他蛔蟲線粒體pcox1與pnad 5串聯基因核苷酸序列系統進化分析

3 討論

馬副蛔蟲病是馬、驢等動物常見的寄生蟲病，可導致宿主出現嚴重的臨床疾病，甚至死亡[5]。馬副蛔蟲在我國新疆、內蒙古等養馬業發達地區分布廣泛。魏梓霖等[8]調查結果顯示，我國部分地區賽馬馬副蛔蟲感染率達4.83%，其結果與圖爾蓀·薩迪爾等[9]對新疆阿勒泰地區馬匹馬副蛔蟲感染情況基本一致，雖然其感染率相對較低，但該病對宿主危害巨大，是我國馬養殖過程中應重點防控的寄生蟲病之一。然而，目前對于馬副蛔蟲病的研究主要集中于流行情況調查與藥物防控等研究，對該類寄生蟲的種類鑒定與遺傳進化研究較少。

在生物進化過程中，生態環境變化可能導致寄生蟲發生遺傳變異，而傳統的形態學鑒定無法判定蟲株是否發生遺傳變異。線粒體DNA具有進化速率快和母系遺傳等特點，可作為可靠的分子標記應用于寄生蟲的遺傳進化研究中。大量研究表明，蛔蟲線粒體cox1與nad5基因序列在種內相對保守，但也存在一定的遺傳變異[10-14]。本試驗通過對9個斑馬源蛔蟲樣品線粒體pcox1和pnad5基因序列進行擴增與分析，發現其同源性分別為99.3%～100.0%和98.1%～99.5%，與GenBank中收錄的馬副蛔蟲分離株基因序列相似性分別為99.5%～100.0%(pcox1)和97.6%～99.8%(pnad5)，與P.univalens分離株基因序列相似性分別為99.2%～100.0%(pcox1)和97.9%～99.3%(pnad5)，且基于pcox1和pnad5串聯基因序列構建的進化樹分析結果顯示，所有的斑馬源蛔蟲樣品與已知馬副蛔蟲和P.univalens聚為同一分支，與其他蛔蟲所屬分支相隔較遠。結果表明斑馬源蛔蟲為馬副蛔蟲或P.univalens，同時也支持馬副蛔蟲與P.univalens為同一個種的觀點[3]，與Peng等[5]調查結果有一定差異，出現不同結果原因可能與構建系統進化樹所選擇的分子標記不同有關。

本試驗對9個斑馬源蛔蟲樣品線粒體cox1和nad5基因部分序列進行擴增與分析，發現斑馬源蛔蟲pcox1和pnad5基因序列均存在一定的遺傳變異情況，且pnad5遺傳多樣性高于pcox1，但二者均較低。進一步試驗結果將斑馬源蛔蟲鑒定為馬副蛔蟲或P.univalens，可初步確定馬副蛔蟲和P.univalens為同一個種，但這兩種線蟲是否為同一個種還需要進一步研究，如通過分析馬副蛔蟲和P.univalens全基因組序列信息等。