雞柔嫩艾美耳球蟲HP基因的真核表達及其對雞巨噬細胞凋亡的影響

許中衎 , 王黎霞，張榕珍，張一弛，芳 卉，潘晨帆，張建軍，安 健

(1.北京農學院動物科學技術學院 國家級動物類實驗教學示范中心，北京 昌平 102206；2.北京農業職業學院畜牧獸醫系，北京 房山 102442)

雞球蟲病是由艾美耳屬的單種或多種雞球蟲引起的主要侵襲雞腸道的全球性寄生蟲病，是嚴重危害我國養禽業的常見疾病之一。經統計，全球養禽業每年因球蟲感染造成的經濟損失高達20億美元[1]。細胞凋亡是由基因調控的細胞自主性死亡的過程[2]，它對于多細胞生物個體生長發育的正常進行，機體生長發育，自穩平衡的保持，維持組織穩態，抵御外界各種因素的干擾及在胚胎發育、造血、免疫系統的成熟，還有維護正常組織和器官的細胞恒定與生長平衡、乃至機體衰老方面都起著重要的作用[3]。本實驗室前期研究發現，柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella,E.tenella)會抑制宿主細胞的凋亡[4-5]。

HP基因編碼的蛋白是由本實驗室前期工作發現的一種柔嫩艾美耳球蟲的外分泌蛋白，目前尚無該基因及其編碼的蛋白的相關功能研究論文的發表。前期對其進行的生物信息學分析發現，該蛋白有望成為重要的潛在藥物靶點或疫苗候選抗原。

本試驗旨在構建重組真核表達質粒pEGFP-HP，將其轉染至細胞內，觀察HP基因對細胞凋亡的影響，探究HP基因是否為柔嫩艾美耳球蟲促進宿主細胞凋亡的主要作用蛋白。本試驗為進一步研究HP基因的生物學功能及其作用機制提供了依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗蟲株與細胞E.tenellaB4株，由北京農學院病理實驗室提供，分離自昌平某雞場，復壯周期為3個月；HD11細胞，本實驗室保存用于雞球蟲研究的貼壁細胞系。

1.1.2 試驗動物 1日齡農大3號公雛雞，將其飼喂于無球蟲及其他病原環境中，使用不含抗球蟲藥的雛雞飼料，飼喂至14日齡，期間自由采食。

1.1.3 主要試劑 熒光真核表達載體pEGFP-N1，購自上海索萊寶生物科技有限公司；E.coliDH5α感受態細胞，購自北京中美泰和生物技術有限公司；TRIzol試劑，購自美國賽默飛世爾科技公司；2×TaqDNA聚合酶，購自北京康為世紀生物科技有限公司；DNA Marker，購自北京天根生化科技有限公司；反轉錄試劑盒、質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒，均購自美國TaKaRa公司；限制性內切酶SacⅠ/EcoR Ⅰ、DNA連接酶，均購自美國NEB公司；無內毒素質粒大量提取試劑盒，購自美國Omega Bio-Tek公司；LipofectamineTM2000 Transfection Reagent，購自美國賽默飛世爾科技公司；DMEM高糖培養基，購自賽默飛世爾科技公司；Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 凋亡檢測試劑盒，購自北京友誼中聯生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 在NCBI上找到目的基因的mRNA序列，導入DNAMAN軟件分析酶切位點，導入Prime 5.0軟件中設計HP基因引物上游引物：5′-GGAGCTCATGGCGGATCAGCTTACCGAG-3′(下劃線部分為SacI酶切位點)；下游引物：5′-CGGAATTCTTACTTCGCAAGCATCATTCCCACGAACTCCTCA-3′(下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點)。引物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行合成。

1.2.2HP基因的克隆 取柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊按7×104個/只接種于7日齡無球蟲雞，88 h后剖殺取盲腸，刮腸黏膜，勻漿，使裂殖子游離出來，100目網篩過濾勻漿，用洗脫液重懸，過柱收集純化后的裂殖子。用1 mL TRIzol試劑將得到的裂殖子重懸，按試劑盒說明書提取RNA，利用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。PCR的反應體系為20 μL:2×TaqDNA聚合酶為10 μL，上、下游引物均為0.5 μL，cDNA模板為2 μL，用ddH20補足至20 μL。PCR反應條件:94 ℃ 2 min；(94 ℃ 30 s、65.5 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s)×40個循環；72 ℃ 90 s。PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，后用凝膠回收試劑盒將其回收，-20 ℃保存。

1.2.3 重組熒光真核表達載體pEGFP-HP的構建 用SacI/EcoR I內切酶雙酶切真核表達載體pEGFP-N1和HP基因，后用凝膠回收試劑盒將酶切產物回收，將真核表達載體pEGFP-N1和HP基因的酶切產物按1∶3體積比通過DNA連接酶進行連接，接著將連接產物轉化入DH5α感受態細胞中，將菌液涂布于卡那霉素抗性LB平板上，37 ℃過夜培養。第2天挑取單菌落接種至LB液體培養基中，37 ℃，150 r/min繼續過夜培養，次日取2 μL以上菌液進行菌液PCR鑒定，菌液PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定后，用凝膠回收試劑盒將其回收，并用以上菌液提取質粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序鑒定。之后取大量以上菌液用無內毒素質粒大量提取試劑盒提取重組質粒pEGFP-HP，-80 ℃保存。

1.2.4 pEGFP-HP轉染HD11細胞 對生長狀況好的HD11細胞進行計數，大約2×105個/孔，加至24孔板中，在37 ℃ 5%CO2細胞培養箱中培養12 h，待細胞貼壁生長至80%～90%時可進行細胞轉染。轉染首先需配制轉染復合液，分別配制轉染A液和B液，按照質粒(μg)和LipofectamineTM2000(μL)1∶1.5的比例進行配制，各自室溫靜置5 min后輕輕混勻結合，再室溫靜置20 min。向HD11細胞中加入轉染復合物100 μL/孔，充分混勻，繼續放入37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養5 h后，棄掉舊培養液，添加新的培養液繼續在37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養36～48 h，用熒光顯微鏡觀察細胞轉染情況。此試驗分別設置了重組質粒組、空質粒組和對照組，其中對照組中無質粒，不進行質粒轉染。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 轉染HD11細胞42 h后，利用流式細胞術檢測空質粒組、重組質粒組和對照組中細胞凋亡的情況，將細胞中的舊培養液棄去，用預冷的PBS洗3遍，用1×Binding Buffer重懸收集細胞至密度為1×106個/mL，室溫避光下向100 μL細胞懸液中加入5 μL Annexin V-Alexa Fluor 647和10 μL PI，輕輕混勻，15 min后用流式細胞儀對細胞的早期凋亡以及晚期凋亡情況進行檢測。

2 結果

2.1HP基因克隆的鑒定 瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，擴增片段大小在450 bp(圖1)，與HP基因的實際大小相一致。結果說明HP基因擴增成功。

圖1 HP 基因的PCR擴增

2.2 重組真核表達載體pEGFP-HP的鑒定 將pEGFP質粒和HP基因用SacI/EcoR I分別進行雙酶切，各取5 μL雙酶切產物進行連接前的質控(圖2)，最終按照亮度比較確定連接比例為1∶3。然后將含有pEGFP-HP重組質粒的大腸桿菌菌液作為模板進行PCR鑒定，共挑取8個陽性單菌落，結果顯示均出現大小在450 bp的條帶(圖3)。之后將其進行BLAST分析，證明是HP基因(圖4)。結果說明重組熒光真核表達載體pEGFP-HP構建成功。

圖2 雙酶切產物的電泳分析

圖3 菌液PCR鑒定的電泳分析

圖4 測序分析

2.3 轉染細胞中HP基因的表達 將pEGFP-HP重組質粒轉染至HD11細胞內，待至42 h后在熒光顯微鏡下觀察出現綠色熒光(圖5B)；pEGFP空質粒組也發現綠色熒光(圖5A)，而未轉染質粒的對照組無熒光(圖5C)。結果證明重組質粒pEGFP-HP已轉染至細胞內且成功在細胞內進行了表達。

圖5 轉染42 h后的HD11細胞(400×)

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 流式細胞術檢測細胞凋亡結果發現，pEGFP-HP重組質粒組正常細胞占25.77%，早期凋亡細胞占40.21%，晚期凋亡細胞占29.90%，死亡細胞占4.12%；pEGFP空質粒組正常細胞占84.21%，早期凋亡細胞占6.02%，晚期凋亡細胞占4.51%，死亡細胞占5.26%；空白對照組正常細胞占73.28%，早期凋亡細胞占15.27%，晚期凋亡細胞占6.87%，死亡細胞占4.58%(圖6)。經分析發現，pEGFP-HP重組質粒組的早期凋亡率極顯著高于pEGFP空質粒組和空白對照組(P<0.01)。

圖6 流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況

3 討論

柔嫩艾美耳球蟲感染的雞輕則僅存在輕微的食欲不振、神經萎靡，重則導致死亡[6]，故對柔嫩艾美耳球蟲的防治方法的研究迫在眉睫。柔嫩艾美耳球蟲是主要侵襲雞腸道的寄生蟲，有研究表明，柔嫩艾美耳球蟲會通過影響雞腸道上皮細胞的細胞凋亡來維持自身良好的寄生環境[7]，從而保持自身的持續感染力而不斷繁衍存活下去。細胞凋亡是機體為適應環境進行的主動程序性的細胞死亡過程[8]，相較于其他細胞死亡方式來說是自衛性質的死亡，具有積極效應。關于球蟲和細胞凋亡的研究近幾年層出不窮，有研究表明，雞感染柔嫩艾美耳球蟲后，發現宿主細胞的凋亡增多，且第2代裂殖生殖期最多[9]；牛柔嫩艾美耳球蟲子孢子的感染能夠抑制牛胎胃腸細胞(BFGC)和非洲綠猴腎細胞(VERO)的細胞凋亡[10]。以上試驗都表明，柔嫩艾美耳球蟲的感染會影響宿主細胞的細胞凋亡，但球蟲影響細胞凋亡的具體的作用機制還尚不清楚。

HP基因編碼的蛋白是由本實驗室前期工作通過將柔嫩艾美耳球蟲第2代裂殖子與馬-達氏牛腎細胞(MDBK)進行無血清間接共培養所得到的一種柔嫩艾美耳球蟲的外分泌蛋白，通過對其進行的生物信息學分析預測發現，HP基因的蛋白質二級結構導致其易發生結合反應，不含信號肽，且存在5個潛在的抗原表位，這些特性說明此基因具有重大的體外研究意義。

細胞轉染技術是分析外源基因或基因產物功能的一個重要工具[11]，能夠很直觀的得到試驗結果。本試驗通過將HP基因轉染進入宿主細胞內來分析它的功能，在本次試驗前，我們分別將HP基因轉染了MDBK、雞成纖維細胞(DF-1)以及HD11等雞柔嫩艾美耳球蟲的宿主細胞，最后發現HD11的轉染效率最佳，故本試驗最終選擇了HD11作為試驗細胞。

本試驗通過構建HP基因的重組真核表達質粒pEGFP-HP，轉染HD11來探討HP基因的潛在生物學功能及其作用機制。本試驗以雞柔嫩艾美耳球蟲HP基因為研究對象，利用RT-PCR及分子克隆技術成功構建了重組真核表達質粒pEGFP-HP，然后將其轉染至HD11細胞內，待至42 h后在熒光顯微鏡下觀察看到綠色熒光，隨后對其進行細胞凋亡情況的檢測，流式細胞術結果顯示，pEGFP空質粒組和空白對照組細胞凋亡率差異不大，說明真核表達質粒pEGFP并不會對宿主細胞的細胞凋亡產生影響。pEGFP-HP重組質粒組的早期凋亡細胞占40.21%，晚期凋亡細胞占29.90%，均高于pEGFP空質粒組和空白對照組，且早期凋亡率顯著高于pEGFP空質粒組和空白對照組，這說明HP基因的出現導致了宿主細胞的凋亡，且主要誘導宿主細胞的早期凋亡。值得一提的是，本實驗室前期試驗通過將柔嫩艾美耳球蟲第2代裂殖子與MDBK共培養的方式發現，柔嫩艾美耳球蟲會抑制MDBK的細胞凋亡，看似這2個結果有矛盾，其實不然，因為有研究表明[12]，在感染的不同時間段，柔嫩艾美耳球蟲對宿主細胞凋亡的影響也不同，在柔嫩艾美耳球蟲感染的早期(24 h以內)，宿主細胞的凋亡被抑制，而到感染的中后期(24～48 h，48～120 h)，宿主細胞的凋亡又發生了促進，這也說明HP基因在轉染宿主細胞的中期誘導了細胞凋亡；又或許HP基因在感染期間都起到了誘導宿主細胞凋亡的作用，這可以說明柔嫩艾美耳球蟲參與影響宿主細胞凋亡的蛋白各自發揮著不同的作用，其最終目的都是為了更好的生長發育、繁衍后代。因為轉染細胞36～48 h后的外源基因才能轉入細胞內，且效果最佳，而此時都屬于感染中期，故關于不同時間段的研究還具有局限性，還需要做進一步的探究，本試驗結果表明，柔嫩艾美耳球蟲HP基因與宿主細胞凋亡有關，且在其感染中期會誘導宿主細胞的凋亡，其中還會顯著誘導宿主細胞的早期凋亡(P<0.01)。本次試驗也將HP基因從此命名為柔嫩艾美耳球蟲凋亡誘導基因(IA)。