2株J亞群禽白血病病毒毒株的分離鑒定及全基因組序列分析

郭雨欣，游廣炬，李曉齊，高 麗，鄭世軍，王永強

(中國農業大學動物醫學院 農業部動物流行病學重點實驗室，北京 海淀 100193)

禽白血病是由反轉錄病毒科反轉錄病毒屬的禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)引起的一種腫瘤性疾病，可以造成雞的免疫抑制及生長遲緩，給養雞業帶來了巨大的經濟損失[1-3]。根據ALV囊膜糖蛋白抗原性可將其分為7個亞群，分別為A、B、C、D、J、K亞群及E亞群，其中E亞群為內源性病毒，一般沒有致病性或致病性很弱[2]。J亞群ALV是我國目前流行范圍最廣，帶來經濟損失最大的禽白血病病毒[4]。自1999年我國首次從雞場病雞中分離出ALV-J以來，ALV-J迅速在全國各地流行[5-7]。近年發現流行的ALV-J的囊膜基因發生了多處堿基突變，并出現J亞群與其他亞群病毒產生重組毒株的現象，給ALV防控帶來了新的挑戰[8-10]。

2019年12月和2020年7月，河北某雞場的地方品系雞群中先后發生2起疑似禽白血病的疫情，本試驗采集病雞的血漿和組織病料，通過接種DF-1細胞，分離出2株禽白血病病毒，經鑒定這2株病毒均為J亞群毒株，分別命名為CAU2019和CAU2020。通過克隆獲得這2個毒株的全基因組序列，并對其核苷酸序列進行同源性分析及構建長末端重復序列(LTR)、gp85基因的遺傳進化樹，為更好的了解我國目前ALV流行毒株的進化趨勢，以及ALV的防控和凈化提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 血漿和病料組織樣本分別于2019年12月和2020年7月采集自河北某雞場地方品種雞。禽白血病病毒ELISA抗原檢測試劑盒，購自動物用生物制品國家工程研究中心(NECVB)；DF-1細胞、禽白血病病毒P27單克隆抗體，由本實驗室保存；DMEM、PBS和胰酶，均購自中科邁晨(北京)科技有限公司；大腸桿菌DH5α感受態細胞、pEASY-Blunt Zero Cloning Kit，均購自北京全式金生物技術有限公司；Q5高保真酶，購自NEB(北京)有限公司；組織細胞基因組DNA快速提取試劑盒，購自北京艾德萊生物科技有限公司。

1.2 病雞剖檢及病毒分離鑒定 剖檢病死雞，將病料研磨過濾所得的病毒液和血漿樣品接種于DF-1細胞，并設立空白對照，盲傳2代后，在第7天提取細胞上清用禽白血病病毒P27抗原ELISA檢測試劑盒檢測P27抗原。

1.3 ALV全病毒DNA的制備 取P27檢測陽性的細胞培養上清接種DF-1細胞，3 d后用組織細胞基因組DNA快速提取試劑盒提取接種后的DF-1細胞DNA，獲取ALV全病毒DNA。

1.4 全病毒基因組 PCR擴增以ALV-J經典毒株HPRS103(GenBank：Z46390.1)的序列為參考設計3對 引物，引物序列見表1，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以1.3中得到的ALV全病毒DNA為模板，用NEB Q5高保真酶進行PCR擴增。

表1 ALV-J全基因組擴增所用引物序列

1.5 克隆測序 PCR擴增所得產物回收純化后，按說明書將目的片段連接到pEASY-Blunt Zero載體上，轉化DH5α大腸桿菌后，接種LBA平板并過夜培養，挑取單菌落進行PCR鑒定，陽性菌液送往北京諾賽基因組研究有限公司測序。

1.6 全基因組序列拼接及分析 使用DNASTAR的SeqMan軟件對2個毒株的各3段測序結果進行拼接，獲得全基因組序列。然后用DNASTAR的MegAlign軟件將獲得的CAU2019和CAU2020全基因組序列與國內外公布的其他ALV毒株進行同源性比對。采用MEGA-X軟件用最大似然法對分離的ALV全病毒序列和其他ALV亞群毒株進行遺傳進化分析，Bootstrap值為1 000。本試驗所用參考毒株見表2。

表2 ALV參考毒株信息

2 結果

2.1 病雞剖檢 剖檢病死雞，可見病死雞肝臟腫大，表面有灰白色小點狀腫瘤灶；脾臟腫大且呈灰棕色；心臟表面可見灰白色腫瘤結節(圖1)。

圖1 病雞的病理剖檢

2.2 病毒的分離及鑒定 取病死雞的肝脾組織研磨液及血漿樣品接種DF-1細胞，盲傳2代后收集細胞上清，用ALV P27抗原ELISA試劑盒檢測，結果有2個 樣品為陽性，對照組檢測結果為陰性。分離得到2株ALV毒株，分別命名為CAU2019和CAU2020。

2.3 全病毒基因組序列PCR擴增 使用1.4中的引物擴增2株病毒全病毒基因組，分別擴增出3段大小約為3 000 bp的特異性條帶，與預期的目的基因片段大小相符(圖2)。

圖2 病毒全基因組DNA的PCR擴增

2.4 分離毒株基因組序列測定 通過DNASTAR的Seqmen軟件對2個毒株的測序序列進行拼接，得到CAU2019與CAU2020的全病毒基因組序列，將序列上傳至GenBank,登錄號分別為MW891539和MW891540。其中，CAU2019全長7 610 bp，CAU2020全長7 594 bp。2株病毒間的基因組序列同源性為95.27%。2個毒株結構均符合典型反轉錄病毒基因組的結構特點，即LTR-gag-pol-env-LTR。其中，CAU2019的LTR段長度為325 bp，gag長度為2 106 bp，pol長度為2 622 bp，env長度為1 686 bp；CAU2020的LTR段長度為325 bp，gag長度為2 094 bp，pol長度為2 622 bp，env長度為1 692 bp。

2.5 分離株與現有毒株序列同源性分析 利用DNASTAR軟件對2個分離株全基因組與GenBank 中收錄的國內外ALV參考毒株進行同源性分析。結果顯示，CAU2019與2011年山東分離的SD110503(GenBank登錄號:KF562374.1)同源性最高，為95.7%；CAU2020與2009年江蘇分離的JS09GY3(GenBank登錄號:GU982308.1)同源性最高，為97.0%。2個分離株與J亞群參考株同源性均在94.1%～97.0%(表3)。

表3 ALV分離毒株全基因組核苷酸序列的同源性分析

利用DNAMAN軟件，將2個分離株與表中提到的與它們同源性最高的ALV-J毒株進行全基因組序列比對。比對發現，CAU2019在3′UTR有30 bp和11 bp的2段不連續堿基缺失；CAU2020在3′UTR 有29 bp的1段堿基缺失。

利用DNASTAR軟件對2個分離株的各基因片段與ALV各亞群參考毒株進行同源性分析。結果顯示，2個分離株的gag和pol基因相對保守。CAU2019的gag與各參考株同源性在94.5%～96.3%，CAU2019的pol與各參考株同源性在97.0%～98.4%；CAU2020的gag與各參考株同源性在94.5%～96.2%，CAU2020的pol與各參考株同源性在96.5%～97.8%。2個分離株LTR基因序列都與J亞群參考株同源性最高，CAU2019的LTR與J亞群HPRS103和ADOL-7501同源性最高，達93.2%，與K亞群SD0501同源性最低，僅64.4%;CAU2020的LTR與J亞群HPRS103同源性最高，達92.3%，與K亞群JS13LY19同源性最低，僅64.4%。CAU2019和CAU2020的gp85、gp37基因片段與J亞群各參考株同源性最高，為93.8%(HPRS103)和94.2%(SD07LK1)，與其余亞群參考株同源性較低，最高僅有51.5%和60.1%，表明該毒株屬于J亞群(表4)。

表4 CAU2019株、CAU2020株各基因片段與不同亞群毒株核苷酸序列的同源性分析

利用MEGA-X軟件分別對CAU2019和CAU2020株的gp85和LTR基因進行遺傳進化分析。gp85是鑒定ALV亞群的主要依據，結果如圖4所示，2個分離株gp85基因片段與J亞群中國分離株JS16JH9的親緣關系最近，與J亞群各毒株在同一進化支上，進一步表明2個分離株是J亞群ALV。2個分離株LTR基因片段與J亞群JS09GY3、SDAU1102、SD1005、Fu-J4親緣關系最近，同屬一個大的進化支。

圖4 2個ALV分離株gp85基因(A)、LTR基因(B)系統進化樹

3 討論

自20世紀90年代首次從肉雞群中分離出ALV-J以來，其便在世界各地流行，致病作用和宿主范圍不斷擴大[2,11]。作為一種免疫抑制病，在實際生產中禽白血病常與其他疾病混合感染，給養禽業帶來了重大經濟損失[12-14]。此外，由于ALV是單鏈RNA病毒，病毒基因組結構不穩定，非常容易發生突變和重組，給疫苗的研發和疾病的預防也帶來了困難[6,15-16]。

本試驗從河北某雞場地方品種雞中分離出2株禽白血病病毒，經PCR鑒定后，又對2個毒株進行了序列同源性分析與遺傳進化分析。序列分析顯示，分離株CAU2019與2011年山東分離的SD110503(GenBank登錄號:KF562374.1)同源性最高，為95.7%；CAU2020與2009年江蘇分離的JS09GY3(GenBank登錄號:GU982308.1)同源性最高，為97.0%。2個毒株的pol和gag基因序列比較保守，而gp85與gp37基因序列突變較多。此外，通過將分離株病毒的全基因組序列與表3中J亞群參考毒株進行比較，發現CAU2019在 3′UTR的7 030 bp與7 399 bp處有30 bp和11 bp的2段不連續堿基缺失，其30 bp堿基缺失的位置和長度與ALV-J廣東分離毒株(GD13HY和GD1411-4)、廣西分離株(GX14FF03)和英國分離株(MQNCSU)的基因序列相似，11 bp堿基缺失的位置和長度與ALV-J廣東分離毒株(GD1408-2)和廣西分離株(GX14ZS14)相似。CAU2020在3′UTR的7 005 bp處有29 bp的1段 堿基缺失，該缺失的位置和長度與ALV-J廣東分離毒株SCAU1903基因序列相似。

根據gp85和LTR的序列同源性分析及遺傳進化分析結果，推測CAU2019和CAU2020均為J亞群禽白血病病毒。CAU2019可能來源于山東的肉雞分離株SD110503，CAU2020可能來源于江蘇的肉雞分離株JS09GY3。CAU2019與CAU2020在3′UTR段的缺失突變與廣東和廣西的少數幾株ALV-J和英國的1株ALV-J十分相似。由此猜想，本試驗中2株 河北ALV分離株的親代或祖代可能與廣東和廣西的ALV-J發生過基因重組，亦或者3′UTR段的堿基缺失是自然進化中的一種演變趨勢[7]。有研究顯示，禽白血病病毒3′UTR對病毒的轉錄有調控作用，3′UTR區域的堿基缺失能夠增強ALV-J的體內復制能力，從而增強ALV-J的致病力，本分離株3′UTR的變異與近年來ALV-J致病性的增強是否有關有待進一步研究[12-14]。近年來ALV毒株突變的可能性有加大趨勢，加之我國地方品系雞群中ALV遺傳背景十分復雜，防控和凈化的難度也日益增加[6,17-19]。本試驗豐富了ALV基因組庫資源的同時，還為ALV的進化趨勢提供了一定參考，有助于制定更好的防控措施，減少我國養禽業經濟損失。但是，這些毒株的變異究竟是個例還是具有一定規律性，發生變異后毒株的致病力是否受到影響等問題還有待進一步研究。