3株H9N2亞型禽流感病毒基因組分子特征及遺傳進(jìn)化分析

高鑫鑫，王艷文，郭 晶，趙聰慧，王文婷，劉文強(qiáng)，李旭勇

(聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 聊城 252000)

A型流感病毒是一種RNA病毒，根據(jù)病毒表面的血凝素(Hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuramidinase，NA)分為不同的亞型(H1～H18和N1～N11)。除了在蝙蝠中分離的H17N10和H18N11亞型流感病毒[1-2]，在禽類可檢測(cè)到所有亞型流感病毒(H1～H16和N1～N9)。流感病毒不僅能感染雞、鴨等禽類，還能夠感染人。H1N1、H2N2和H3N2亞型流感病毒可在人類傳播，在歷史上引起了數(shù)次大流行[3]。H5N1、H5N6、H7N9和H9N2等亞型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)能夠直接從動(dòng)物感染人類，表明這些亞型的病毒可能具有通過進(jìn)一步進(jìn)化而成為引起新的大流行病的潛在威脅[4-6]。1966年，首次在家禽中發(fā)現(xiàn)H9N2亞型流感病毒[7]。研究表明，H9N2 AIV能夠?yàn)楦腥救祟惖腍5N1、H5N6、H7N9 和H10N8等亞型AIV提供內(nèi)部基因[8-12]。同時(shí)，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，H9N2同H4N6 AIV共感染家禽后在宿主體內(nèi)會(huì)發(fā)生高頻率的基因重組，并產(chǎn)生比野生型病毒具有更高毒力的子代重組病毒[13]。

為更深入了解H9N2 AIV遺傳演化規(guī)律，本試驗(yàn)于2017—2019年在活禽市場(chǎng)采集樣品，分離選取3株 H9N2 AIV進(jìn)行全基因組序列測(cè)定、遺傳進(jìn)化及關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析，總結(jié)了數(shù)據(jù)庫(kù)中歷年H9N2分離株HA基因關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的變異規(guī)律，為進(jìn)一步了解H9N2 AIV的進(jìn)化、變異規(guī)律提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒及雞胚 試驗(yàn)中所用的3株H9N2分離株A/chicken/Weifang/862/2017(簡(jiǎn)稱CK/862/17)來源于濰坊某養(yǎng)殖場(chǎng)病雞組織、毒株A/chicken/Liaocheng/844/2018(簡(jiǎn)稱CK/844/18)和毒株A/pigeon/Liaocheng/168/2019(簡(jiǎn)稱PG/168/19)均來源于山東省農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。其中CK/862/17和CK/844/18宿主為雞，PG/168/19來源于鴿子。SPF雞胚，購(gòu)自濟(jì)南斯派福瑞禽業(yè)科技有限公司。

1.2 試劑 RNA提取試劑盒(TIANamp Virus RNA Kit,DP315-R)，購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ReverTra Ace qPCR RT Kit)和PCR混合劑(Quick Taq?HS DyeMix)，均購(gòu)自TOYOBO科技有限公司；分子量Marker，購(gòu)自TaKaRa公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒，購(gòu)自O(shè)MEGA公司；測(cè)序反應(yīng)由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3 病毒的分離 采集山東活禽市場(chǎng)售賣家禽的泄殖腔和咽喉拭子；取發(fā)病雞氣管、喉頭、肺組織置于前期加入雙抗的PBS緩沖液中，以60 Hz的頻率研磨2 min。然后以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液0.25 mL接種于10日齡的雞胚中，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后收取雞胚尿囊液，分裝并置于-80 ℃保存。

1.4 RT-PCR 鑒定及序列測(cè)定 取尿囊液提取其RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用禽流感病毒HA的鑒定引物對(duì)其亞型進(jìn)行鑒定。接著利用H9N2亞型病毒各基因節(jié)段測(cè)序引物以50 μL的體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，50 μL體系：cDNA 2 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，Mix 25 μL,H2O 21 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s；退火溫度58 ℃，退火時(shí)間30 s，68 ℃ 延伸1 min 30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，并將膠塊置于凝膠成像儀下觀察，將特異性條帶膠回收純化后送至測(cè)序公司利用測(cè)序引物進(jìn)行病毒的全基因序列測(cè)定。

1.5 遺傳演化分析 將各基因節(jié)段測(cè)序結(jié)果導(dǎo)出后利用DNASTAR 7.1中的MegAlign程序?qū)?個(gè)基因片段序列拼接，應(yīng)用NCBI中BLAST檢索相似性序列以及代表性毒株序列，利用MEGA 7.0軟件對(duì)各基因節(jié)段的序列進(jìn)行同源性及關(guān)鍵位點(diǎn)的分析，并利用Neighbor-joining 法繪制下載序列與分離毒株序列8個(gè)基因片段的遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 全基因組序列的測(cè)定

2.1.1 核苷酸同源性分析 從2017—2019年分離的H9N2 AIV中，根據(jù)分離年份、地區(qū)和宿主，選出3株 分離株CK/862/17、CK/844/18和PG/168/19進(jìn)行全基因組序列的測(cè)定，在NCBI中BLAST上比對(duì)分析，繪制8個(gè)基因節(jié)段遺傳進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，CK/862/17和CK/844/18的8個(gè)基因節(jié)段與近幾年流行的H9N2病毒高度同源；PG/168/19的8個(gè)基因節(jié)段來源復(fù)雜，PB2和PB1與H7N9同源性較高，其中PB2與A/Chicken/Anhui/AH395/2017(H7N9)(GenBank 登錄號(hào)MG575543.1)同源性為98.38%，PB1與A/Changsha/26/2017(H7N9)(GenBank 登錄號(hào)MF370244.1)同源性為98.90%(表1)。

表1 與分離株各基因片段的核苷酸同源性最高的病毒株

2.1.2 分離株與疫苗株HA、NA基因同源性分析 3株分離株與當(dāng)前市場(chǎng)上的疫苗株進(jìn)行HA、NA基因序列比對(duì)分析表明，與LG1株的同源性最高，HA基因序列的同源性為94.1%～95.1%，NA基因序列的同源性為93.9%～95.3%，但分離株與其他疫苗株的同源性較低(表2)。另外近年來，H9N2亞型AIV經(jīng)常在已免疫過疫苗的雞群中分離出[14],說明目前流行的H9N2病毒與早期H9N2疫苗毒株相比已發(fā)生抗原的改變，致使現(xiàn)有的疫苗保護(hù)效力降低或者失效。這就需要企業(yè)生產(chǎn)疫苗與流行毒株的抗原性相匹配。

表2 3 株分離株與疫苗株 HA、NA基因的同源性比較

2.2HA基因的分子特征、同源性和遺傳分析

2.2.1HA基因序列的進(jìn)化分析 3株H9N2分離株與參考毒株的HA基因序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，繪制基因進(jìn)化樹(封三彩版圖1A)。HA基因的遺傳進(jìn)化分為歐亞種系和北美種系，3株分離株的遺傳距離較近，均屬于歐亞分支的Y280亞群。3株分離株HA基因的核苷酸同源性為95.6%～98.0%。

2.2.2 HA蛋白關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析 HA蛋白裂解位點(diǎn)的氨基酸組成均為RSSR↓GLF，符合低致病性AIV的特征。與早前分離的經(jīng)典毒株相比，3株分離株的受體結(jié)合位點(diǎn)在第101、138、153、155、194、195位和第228位相對(duì)保守，第183位突變?yōu)镹，第190 位突變?yōu)門。左側(cè)壁(第240～245位)的氨基酸組成形式均為NGLMGR，右側(cè)壁(第138～142位)為GTSTA。3株分離株第226位受體結(jié)合位點(diǎn)均為L(zhǎng)，具有與哺乳動(dòng)物α,2-6唾液酸受體結(jié)合的特征(表3)。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載2019年之前所分離的H9N2流感病毒的HA蛋白氨基酸序列，對(duì)其第183、190位和第226位氨基酸殘基位點(diǎn)分析表明：H9N2流感病毒的受體結(jié)合位點(diǎn)顯現(xiàn)多樣性，其中H9N2 AIV的HA蛋白第226位氨基酸主要以Q和L為主，但也出現(xiàn)了一些Q和L 之外的氨基酸，如M、F等新的氨基酸。從整體趨勢(shì)上來看，H9N2亞型流感病毒HA蛋白的第183位點(diǎn)由早年的H逐漸向N轉(zhuǎn)化，第109位點(diǎn)主要比例由A向T轉(zhuǎn)化，第226位氨基酸由早年的Q突變?yōu)長(zhǎng)，普遍具有了與哺乳動(dòng)物α,2-6唾液酸受體結(jié)合的特征(封三彩版圖2A～2C)。

表3 分離株HA蛋白的氨基酸序列分析

對(duì)3株分離株HA蛋白潛在糖基化位點(diǎn)分析表明(表4)，HA1蛋白上具有6個(gè)共同的潛在糖基化位點(diǎn)，分別為第21、74、133、290、297位和第305位。HA2蛋白上具有1個(gè)共同的潛在糖基化位點(diǎn)，為第484位，其中分離株CK/844/18在第543位由NGS突變?yōu)镹GR，造成了1個(gè)糖基化位點(diǎn)的缺失。3株分離株HA蛋白的第202～204位氨基酸由NRT突變?yōu)镹RI，造成1個(gè)糖基化位點(diǎn)的缺失；第295～298位由NCP突變?yōu)镹CS，新增1個(gè)糖基化位點(diǎn)，這與數(shù)據(jù)庫(kù)中分離株的變化趨勢(shì)一致(封三彩版圖2D)。

表4 分離株HA蛋白的潛在糖基化位點(diǎn)分析

2.3NA基因的分子特征和遺傳分析 同HA基因的遺傳進(jìn)化樹相類似，NA基因的遺傳進(jìn)化樹也分為歐亞種系和北美種系。3株分離株NA基因均屬于歐亞分支的Y280亞群，核苷酸同源性為97.3%～97.6%(封三彩版圖1B)。3株分離株共有的NA蛋白中有6個(gè)糖基化位點(diǎn)，分別為第44、69、86、146、200位和第234位。分離株CK/862/17在第404位由S突變?yōu)锳，造成1個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)的缺失。3株NA蛋白的第256位氨基酸由S突變?yōu)镽，導(dǎo)致第256位糖基化位點(diǎn)的缺失(表5)。3株分離株的耐藥性相關(guān)基因位點(diǎn)未發(fā)生突變，第274位仍為S，第294位仍為N。

表5 分離株NA蛋白的潛在糖基化位點(diǎn)分析

2.4 分離株內(nèi)部基因遺傳進(jìn)化分析 3株分離株的內(nèi)部基因的同源性依次為M94.2%～97.8%、NP97.3%～98.7%、NS97.4%～98.3%、PA96.3%～96.9%、PB1 94.8%～97.6%、PB2 96.4%～96.8%。分離株CK/844/18與CK/862/17各基因片段的同源性略高于PG/168/19。3 株分離株的內(nèi)部基因呈現(xiàn)多樣性的特點(diǎn)，PB1、PA、NP來自F98亞系(圖3B～3D)；M基因來自G1亞系。分離株的PB2、NS基因與參照標(biāo)準(zhǔn)流感病毒毒株的遺傳進(jìn)化關(guān)系比較 遠(yuǎn)，形成單獨(dú)的Unknown Avian分支。3株分離株的PB2蛋白的第340位和第627位存在差異，CK/862/17與PG/168/19的第340位為K，CK/844/18的第340位為R；CK/844/18與CK/862/17的第627位為E，PG/168/19的第627位為V；第588位均為V，第701位均為D；3株分離株的NS 蛋白中第114、124位和第212位氨基酸分別為S、V、P。第588位的突變使病毒在哺乳動(dòng)物宿主體內(nèi)的復(fù)制、致病及傳播能力增強(qiáng)，NS基因中第114、124位和第212位的突變使干擾素刺激基因(ISGs)mRNA 的轉(zhuǎn)錄活性受到抑制。

圖3 3株H9N2 AIV的 PB2(A)、PB1(B)、PA(C)、NP(D)、M(E)和NS(F)基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

3 討論

H9N2病毒為低致病性AIV，家禽感染H9N2后，生產(chǎn)性能和免疫力降低，易引起繼發(fā)性細(xì)菌感染導(dǎo)致較高的死淘率，嚴(yán)重影響了養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。H9N2病毒的內(nèi)部基因易與其他亞型發(fā)生基因重組，形成一些高致病力的新型流感病毒。

本試驗(yàn)3株分離株HA蛋白的第226位點(diǎn)均為L(zhǎng)，能夠與哺乳動(dòng)物α,2-6唾液酸受體結(jié)合，這與早前分離的H9N2亞型禽流感的特征一致[14]，促使人感染的可能性急劇增加。同時(shí)3株分離株HA蛋白在第295～298位氨基酸由NCP突變?yōu)镹CS，新增了1個(gè)糖基化位點(diǎn)，其可能與病毒感染宿主和宿主免疫反應(yīng)抗原遞呈有關(guān)[15]，相關(guān)機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。PB2蛋白差異性較大，其中T271A、R340K、A588V、E627K、D701N等特異性位點(diǎn)的突變能夠使病毒在哺乳動(dòng)物宿主體內(nèi)的復(fù)制、致病及傳播能力增強(qiáng)[16-17]。NS蛋白中P114S、M124V、S212P氨基酸突變與H9N2亞型AIV拮抗宿主先天性免疫應(yīng)答密切相關(guān)，它能夠顯著抑制干擾素刺激基因(ISGs)mRNA的轉(zhuǎn)錄活性[18]。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，G1-like的PB2和M基因在出現(xiàn)新基因型方面具有重要意義[19-20]。H9N2亞型AIV在我國(guó)流行廣泛，致病性和感染哺乳動(dòng)物的能力逐漸增強(qiáng)，對(duì)我國(guó)公共衛(wèi)生安全造成的潛在危險(xiǎn)也在逐漸增強(qiáng)，此研究從基因水平為探索H9N2 流感病毒的遺傳進(jìn)化規(guī)律及防控提供科學(xué)依據(jù)。