罕見B(A)亞型的血清學特征及基因序列分析

陳靜思，林甲進，張瑛，游維，江明華

溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院，浙江 溫州 325027，1.輸血科；2.醫學檢驗中心

AB0血型系統是輸血醫學中最具重要臨床意義的紅細胞血型系統，血型的準確鑒定在臨床輸血、法醫學、器官移植、親子鑒定中具有重要作用。B(A)亞型是一種罕見的ABO表型，是B等位基因發生突變導致，在血清學表現上既有B抗原的特點，又有A抗原的特性，在血型鑒定時易誤判為B型或AB型，給臨床血型鑒定和臨床輸血造成一定的困難和安全風險[1-3]。鑒于其血清學特征的特殊性，近年來引起臨床的廣泛關注[4-5]。現將我們積累的8例B(A)型標本檢測的血清學特征及基因測序結果總結報告如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2013年3月至2021年6月溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院的8例ABO血型正反定型不一致或抗原減弱的血樣，分別記為標本1～8，其中男2例，女6例，年齡7～69歲，均無血緣關系。入選標準依據《ABO亞型的檢測》要求[6]，排除標準為標本紅細胞與抗-A1凝集素反應陽性者。抽取外周靜脈EDTA抗凝血5 mL待檢。本研究經本院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑與儀器 單克隆抗-A和抗-B、抗-A1凝集素、單克隆抗-H血型定型試劑（上海血液生物醫藥有限公司）；A、B、O細胞由本科室制備；聚凝胺試劑（武漢貝索有限公司）；基因組DNA試劑盒、人類紅細胞ABO血型-B(A)基因分型試劑盒（天津秀鵬生物技術有限公司）。ID-Centrifuge-12S II型離心機；ID-Incubator-37SI型孵育器(瑞士達亞美有限公司)；PCR擴增儀；3730基因測序儀（美國ABI公司)。

1.3 方法

1.3.1 檢測方法：采用單克隆抗-A、抗-B、抗-H、抗-A1凝集素、ABO標準紅細胞采用試管凝集法進行血型檢測；采用聚凝胺交叉配血法，將標本與A型、B型、AB型、O型供血者分別進行交叉配血，標明主次側，主側為患者標本血漿100 μL及供者2%～5%紅細胞懸液50 μL，次側為供血者血漿100 μL及2%～5%標本紅細胞懸液；采用序列特異性引物-聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction sequencespecific primer PCR-SSP）法進行基因分型；采用Sanger直接測序法進行基因測序。嚴格按照儀器試劑說明書及測序方法步驟。

1.3.2 ABO血型基因分型和測序：采用磁珠法提取DNA，用人類紅細胞ABO血型/B(A)亞型基因分型試劑盒（PCR-SSP法），按照說明書操作；采用Sanger測序法將產物送至測序公司進行直接測序；使用chromespro軟件及DNAMAN8.0軟件將測序公司提供的abo序列與ABO基因參考序列（NG_006669.1）進行對比，根據dbRBC數據庫以及ISBT數據庫[Names for ABO（ISBT 001）blood group alleles v1.1 171023]確定基因型。

ABO基因分型、測序分析，在天津秀鵬生物技術有限公司協助下完成。

2 結果

2.1 血清學和基因型檢測結果 8例標本紅細胞與抗-A反應呈1+至2+，與抗-A1反應呈陰性，與抗-B反應呈3+至4+，與抗-H反應呈3+至4+，血清與Ac反應呈2+至4+，與Bc、Oc、自身細胞均不反應；8例樣本經PCR-SSP法檢測ABO基因分型為B(A)亞型。8例標本血清學和基因型檢測結果見表1。

表1 8例標本血清學和基因型檢測結果

2.2 基因測序 8例標本直接測序結果：標本1、3、4、5、7的第六外顯子為c.261delG和c.297A＞G，第七外顯子為c.526 C＞G、c.640A＞G、c.657C＞T、c.703G＞A、c.796C＞A、c.803G＞C、c.930 G＞A雜 合；標本2、6、8的第六外顯子為c.261delG和c.297A＞G，第七外顯子為c.526 C＞G、c.657 C＞/T、 c.700 C＞G、c.703 G＞A、c.796 C＞A、c.803 G＞ C、c.930 G＞A雜合（見圖1、圖2、圖3）。

圖1 B(A)04、B(A)02基因序列主要堿基替換位點

圖2 B(A)04基因測序c.640 A＞G雜合錯義突變

圖3 B(A)02基因測序c.700C＞G雜合錯義突變

2.3 交叉配血 8例樣本主側與A型、AB型供血者紅細胞懸液凝集反應陽性，與B型、O型供血者紅細胞懸液凝集反應陰性；次側與A型、B型、O型供血者血漿凝集反應陽性，與AB型供血者血漿凝集反應陰性。8例樣本與A型、B型、AB型、O型供血者交叉配血結果見表2。

表2 8例樣本與A型、B型、AB型、O型供血者交叉配血結果

3 討論

正常A型、B型、AB型等位基因分別位于第9號同源染色體的ABO位點上，從父親或母親遺傳而來，但極少數人1條9號染色體上存在1個B(A)基因，其編碼酶具有雙功能活性，除催化A抗原、B抗原的合成，還具有表現出AB型的特征，稱為B(A)血型。B(A)抗原形成機制還沒有完全闡明，認為B(A)基因產物既能合成大量尿苷二磷酸半乳糖（UDP-Gal、B抗原糖供體），又能合成少量尿苷二磷酸-N-乙酰半乳糖胺（UDP-GalNAC、A抗原糖供體）到H抗原表面，形成其主要特征。B(A)型的表現頻率極低，國內獻血人群、國外歐洲人群分別報道在1/5萬～1/10萬、1/17萬～1/58萬[7]，文獻報道中國漢族B(A)型等位基因分布在北方和南方基本相似，B(A).04為1.6/10萬人，B(A).02為0.78/10萬人[8]。YAMAMOTO等[9]首先發現由遺傳學上的B型紅細胞表達弱的A抗原為特征的常染色體控制表型，具有順式遺傳方式。1993年，第1次發現了既能編碼正常B糖基轉移酶又具有A糖基轉移酶活性的B等位基因，這個等位基因后被命名為B(A).01。目前已報道有7種B(A)等位基因，分別為B(A).01、B(A).02、B(A).03、B(A).04、B(A).05、B(A).06，B(A).07[10-11]。國內相關文獻報道的B(A)亞型以個案報道和家系為主，等位基因有5種：B(A).02、B(A).04、B(A).05、B(A).06、B(A).07，以B(A).04、B(A).02多見[12-13]。本研究8例標本采用PCR-SSP法對其進行基因分型，確定其基因型B(A).04/O.01.02 2例、B(A).02/O.01.02 2例、B(A).04/O.01.01 2例、B(A).04/A.01.01 1例、B(A).02/O.01.01 1例，以B(A).04、B(A).02為主。

基因測序分析是鑒定疑難血型的重要手段。有研究報道[14]，B(A)亞型主要的血清學特點是其紅細胞與抗-B呈現正常凝集強度、與高效價單克隆抗- A具有明顯反應、與人源性抗-A或經過一定比例稀釋的單克隆抗-A在室溫中不反應、與單克隆抗-H反應凝集強度3～4+，反定型結果與正常B型反應結果一致。本研究8例樣本的紅細胞與單克隆抗-A呈低度凝集強度、與單克隆抗-B呈正常凝集強度、與抗-A1凝集素不反應、與單克隆抗-H反應強度接近O型，正定型結果表現為A弱B特征，呈現“A弱B強”，反定型結果表現為B型特征；其血清學檢測結果與上述文獻報道基本一致，至于B(A)亞型紅細胞是否存在冷反應A抗原及其血清學異質性差異，有待于后續留取該類樣本進行進一步檢測探討。目前B(A)基因突變有c.700 C＞G、c.640 A＞G和c.641T＞C，分別由YU等[15]于1999年、郭忠慧等[16-17]于2004年和2006年首先報道。本研究通過基因測序發現B(A).04與B101/O01序列比對，在640位核苷酸發生A＞G單堿基突變，導致第214位甲硫氨酸轉變為纈氨酸；B(A).02與B101/O02序列比對，在700位核苷酸發生C＞G單堿基突變，導致第234位脯氨酸轉變為丙氨酸，與上述報道一致。本研究中，將罕見的B(A)亞型血清學檢測結果和基因序列分析相結合，為患者血型鑒定和后續臨床輸血提供安全保障。

目前針對B(A)亞型患者的臨床用血尚無統一的評價標準，本研究通過交叉配血實驗表明，B(A)型血型無論被鑒定是AB型還是B型，即輸注AB型懸浮紅細胞或B型的血漿均有產生嚴重溶血反應的可能；鑒于B(A)亞型發現的稀有特征，以致B(A)血型的供血者極少，在臨床上難以滿足同型輸血，基本采用自體或相容性輸注的原則，對B(A)型患者采用自體備血或輸注洗滌B型、O型紅細胞或輸注AB型非紅細胞血液制品。同時在臨床輸血前，當正定型和反定型出現不相符時，需要結合血型血清學、家系成員及采用分子生物學技術方法來正確鑒定和判定血型，避免漏檢ABO亞型，確保后續臨床安全輸血。