具超二倍體特征的多發性骨髓瘤患者染色體核型分析

黃河，林泓豆，郭文堅，李倩

溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院，浙江 溫州 325027，1．血液內科；2．檢驗科

隨著新藥及新治療方式的出現，多發性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）患者的總體生存期（overall survival, OS）明顯延長；大部分MM患者都存在染色體核型改變，而這些細胞遺傳學異常（cytogenetic abnormality, CA）對疾病的發病機制、臨床癥狀、分期、藥物療效和預后有著重要的指導意義，尤其是蛋白酶體后時代（2017年7月進口硼替佐米萬珂納入我國醫保，隨后國產硼替佐米陸續上市），CA已明確成為MM危險度分層的重要指 標[1-4]。超二倍體是指除正常染色體組以外，還有一條或幾條額外的染色體或染色體片段的細胞或個體，研究表明近45%的MM患者中可發現超二倍體，且該變化往往提示較好的預后，但仍有研究對其預后意義存在爭議[5-6]。本研究對溫州醫科大學附屬第二醫院血液科33例初發或復發具超二倍體核型的MM病例進行染色體及熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization, FISH）表達研究，為MM的治療及預后提供參考。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2009年6月至2018年7月溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院收治的150例初發或復發的MM患者，均未接受過移植或CAR-T治療。其中33例為超二倍體核型（染色體數≥47且＜75），7例亞二倍體（染色體數≤44），109例二倍體（染色體數=46），1例近四倍體（染色體數＞75）。所有MM患者診斷符合張之南等主編的《血液病診斷及療效標準》[7]，分期分型按照《中國多發性骨髓瘤診治指南（2017年修訂）》[8]。

1.2 方法

1.2.1 染色體核型分析：取患者骨髓液6～8 mL，于20%小牛血清的RPMI1640培養液中，37 ℃采用短期培養法培養24～48 h，收集細胞，采用R帶技術顯帶，每例標本分析20個分裂相。核型分析按照 《人類細胞遺傳學國際命名體制（ISCN2009）》描述核型。

1.2.2 FISH檢測：選擇數目異常常見的CSP3/7、D7S522/CSP7、D5S23D5S721/CSF1R、13/21、18XY探針，及位點和融合基因探針：RB1/D13S319 （13q14）、C-MYC（8q24）、IGH（14q32）、P53/1q21（17p13.1/1q21）、PML/RARɑ（15q21/17q21）、BCR/ABL（22q11/9q34）及CCND1/IGH（11q13/14q32）檢測基因。染色體分析剩余的標本，滴片，37 ℃在2×枸櫞酸鈉（saline sodium citrate, SSC）緩沖液中老化30 min，后70%、85%、100%乙醇中梯度脫水各2 min。自然晾干，加探針蓋上蓋玻片，封膠封片，78 ℃變性5 min，39 ℃孵箱雜交過夜。揭去蓋玻片，46 ℃在2×SSC中洗5 min，46 ℃在2×SSC 0.1%的Np-40洗5 min，70%、85%、100%乙醇中梯度脫水各2 min，自然晾干。加DAPI復染，蓋上蓋玻片4 ℃保存。熒光顯微鏡油鏡下選取分散較好的、完整的細胞分裂周期間期和中期分裂相細胞至少200個。結果判讀：觀察細胞核內熒光信號并計數，有2個熒光信號點為正常，多于2個信號點為擴增，僅見1個信號點為缺失。使用日本尼康80-A1熒光顯微鏡拍攝圖像，使用圖像分析軟件AI（Gene Company Limited）進行分析。相關的濾色片包括：DAPI，ORANGE，GREEN，AQUA。

1.3 統計學處理方法 預后生存分析采用Mantel-Cox法構建生存曲線，采用Log-rank檢驗進行比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床特征 本研究在150例MM患者中共檢出超二倍體患者33例，發生率為22%。超二倍體患者年齡49～82歲，中位年齡66歲；男女性別比例9:2，其中28例為初發，5例為復發。23例為IgG型或IgG輕鏈型，5例為IgA輕鏈型，1例IgD輕鏈型。DS分期： I、II期45.5%（15/33），III期54.5%（18/33）；ISS分期：I、II期60.6%（20/33），III期39.4%（13/33）；RISS分 期：I、II期81.8%（27/33），III期18.2%（6/33）。對150例MM患者隨訪至2021年5月，超二倍體患者與非超二倍體患者（包括亞二倍體，二倍體及近四倍體）OS率差異無統計學意義（P=0.735），中位生存時間分別為18.5個月和15個月，見圖1。

圖1 超二倍體與非超二倍體MM患者OS

2．2 染色體核型分析 所示超二倍體均具備染色體三體性，常見增多的染色體按檢出率從大到小依次為+5（23/33），+3（18/33），+19（17/33），+9（16/ 33），+2、+4、+7、+11（均13/33），+10（12/33）、+6、+14、+18、+21（均11/33），+8（10/33），具體染色體核型分布見表1和圖2，與目前文獻發現較常見增加的染色體大致一致，包括3、5、7、9、11、18、19和21號染色體[9-11]，但常見增加表達的15號染色體這里僅為5例，發生率為15.2%。圖3為1例近四倍體MM患者R顯帶核型圖，可見17、18、X染色體呈二倍體，1、10、11、12、13、14號染色體呈三倍體，2、3、4、5、6、7、8、9、15、16、19、20、21、22號染色體呈四倍體。

圖2 超二倍體MM患者染色體增加構成與分布

圖3 1例近四倍體MM患者骨髓染色體核型圖

表1 患者核型特征

續表1

2.3 FISH檢測結果 33例超二倍體MM骨髓標本用探針進一步行FISH檢測，如圖4所示檢出異常有ABL信號擴增（20/33，60.6%），PML信號擴增（16/33，48.5%），1q21信號擴增（15/33，45.5%），RB1缺失（10/33，30.3%），CCND1擴增（8/33，24.2%），IGH擴增（3/33，9.1%），IGH易位（2/33，6.1%），C-MYC重排（2/33，6.1%），P53擴增（2/33，6.1%）。

圖4 超二倍體MM患者骨髓FISH檢測異常分布

2．4 復發超二倍體核型特征 在超二倍體MM患者中，有4例為復發患者，其中1例60個月中復發2次。初發時為二倍體，復發時為超二倍體，增加的三體有常見2、3、4、5、7、8、9、10、11、15、16、18、19、20、21號染色體。僅其中1例雙輕鏈表達的MM初治為超二倍體，復發后表現為正常二倍體核型。見表2。

表2 4例復發超二倍體MM患者核型比較

3 討論

染色體不穩定是MM的常見特征，細胞遺傳學對預后的重要指導意義已達成共識，國際骨髓瘤工作組（International Myeloma Working Group, IMWG）在此基礎上定義了高危患者。目前對CA的分析除傳統的常規核型（conventional chromosome, CC）檢測技術外，還有FISH、高通量基因組分析單核苷酸（single nucleotide polymorphism, SNP）、比較基因組雜交（comparative genomic hybridization, CGH）、基因表達分析技術等。本研究主要是以CC技術為基礎，結合FISH檢測，分析2009至2018年期間我院現存資料較完整的MM患者細胞遺傳學異常情況。本研究發現提示預后較好的超二倍體在MM患者中較常見，且存在染色體三體性，同時往往合并多樣的基因異常表達，包括基因擴增、易位及缺失等；但因樣本量較少，故其對臨床的指導意義相對有限。本研究患者為蛋白酶體抑制劑廣泛應用前時期，故未將當前一線治療方案療效與CA的相關性進行探討。

目前已有較多大樣本研究對染色體數異常與MM預后的相關性進行探討，認為超二倍體發生率較高，且提示較好的預后。對于超二倍體，認為其常見特征是一組一致的奇數染色體，染色體3、5、7、9、11、15、19和21的三體性在MM的發生率為50%～60%；而18號染色體在大多數情況下存在于二倍體中，其在超二倍體中以三體形式出現的情況很少 見[5，9，12-13]。近年YANG等[12]用FISH技術發現97例MM患者中40例為超二倍體，且以5、7、9、11、15和17號染色體三體的形式出現，而增加的染色體也與預后相關。超二倍體合并存在高危CA時則預后欠佳，如del（17p），t（4；14），+1q[14-15]。一項對1 970例初診MM的隨訪研究發現，存在超二倍體或t（11；14）時，兩者并不能改善同時具有不良預后事件MM患者的預后[如t（4；14），t（14；16），t（14；20）]，并且認為超二倍體發生于IGH易位事件前[16]； 但是另一項我國針對201例MM患者的細胞遺傳學分析認為，超二倍體異常可改善具有高危細胞遺傳學患者的不良預后，且僅有高危遺傳學異常但不為超二倍體的患者預后最差[17]。另外較一致的觀點認為亞二倍體異常提示不良預后，并且超單倍體是MM中一種新的高危細胞遺傳學亞群[18]。而近四倍體發生率較低，且多合并染色體結構異常，及異常基因的表達，故其與預后的相關性有待進一步研究，但認為其預后不佳[16]，如本文中1例近四倍體患者，其OS僅為5個月。人們發現較其他類型染色體異常，具有染色體三體性特征的MM患者OS最佳，以+3，+5預后較好，+21預后相對較差，且予以RD（lenalidomide+dexamethasone）化療療效顯著[19]。此外，本研究列出的4例復發MM患者中，3例初診時染色體為二倍體，復發后染色體數為超二倍體，提示可能復發時患者的細胞遺傳學表達較初發時更復雜，但這與患者預后的相關性仍需更多的臨床數據支持。

本研究對象發病較早，蛋白酶體抑制劑可及性較差時期，故未對治療進行探討；另當時所及的CA檢測技術有限，且樣本量較小，故所得研究結論有一定的局限性，如相較超二倍體與非超二倍體的MM患者并未獲得統計學差異的OS率。超二倍體患者所增加的三體染色體特征基本與文獻報導一致，但其與MM患者的分期、分型及臨床癥狀并未發現相關性。所增加的染色體往往合并多種基因的擴增性表達，通過進一步的FISH檢測也發現了相關基因的異常表達，如所提示不良預后的1q21擴增，同時也有ABL、PML及CCND1擴增，但目前的研究僅提示上述擴增與染色體損傷修復相關，并無大樣本的數據證明其在血液腫瘤中的預后指導意義。此外，RB1缺失也較常見，另外我們也發現了IGH易位與IGH擴增，但因總體樣本量關系，并未將其與預后的相關性進行探討。