胰島移植對糖尿病大鼠周圍神經病變的改善作用

陳艷艷，李佳，徐自強，夏念格

溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325015，1.神經內科；2.移植科

糖尿病周圍神經病變（diabetic peripheral neuropathy, DPN）是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，約50%的糖尿病患者深受其害，是糖尿病患者高致殘率、高病死率的主要原因[1]。DPN臨床表現(xiàn)多種多樣，以遠端對稱性多發(fā)性神經病變最常見，引起下肢截肢的風險高達25%，危害極大[2]。糖尿病早期，甚至糖耐量異常階段即可并發(fā)DPN，但早期診斷較困難。雖然高血糖被認為是引起DPN的主要因素，但其具體發(fā)病機制尚不明確，目前仍缺乏有效的治療方法和特異性的藥物[3]。DPN的發(fā)病機制錯綜復雜，炎癥反應和凋亡是DPN重要的發(fā)病機制之一[4]。胰島移植是目前能完全逆轉糖尿病引起的胰島素分泌障礙和代謝紊亂的唯一方法。本研究通過建立糖尿病大鼠模型并進行胰島移植，觀察胰島移植對坐骨神經病理改變的影響、大鼠痛敏反應時間的改變，并觀察促炎因子腫瘤壞死因子α（TNF-α）的mRNA表達變化及B淋巴細胞瘤2蛋白（B-cell lymphoma-2, BCL-2）/BCL-2相關X蛋白（BCL-2 associated X, BAX）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase3）蛋白表達的變化，探討其可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 SPF級健康雄性SD大鼠，體質量180～220 g，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK（浙）2020-0001。

1.2 主要試劑 V型膠原酶和鏈脲菌素（購自美國Sigma公司），雙硫腙（購自上海三愛思試劑有限公司），F(xiàn)BS（購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司），Histopaque?-1077、1119溶液（購自美國GE公司），反轉錄試劑盒（購自日本Takara公司），實時定量PCR試劑盒（購自美國Thermo公司），BCL-2抗體（購自英國Abcam公司），BAX、caspase3、GAPDH抗體（均購自美國CST公司）。

1.3 方法

1.3.1 胰島的獲取、純化：取SD大鼠，持續(xù)乙醚吸入麻醉，于腹部作V形切口，使膽總管充分暴露，于膽總管入十二指腸處用動脈夾夾住十二指腸的兩端；破心處死大鼠后，于膽總管左右肝管分叉處用套管針行膽總管插管；逆行灌注V型膠原酶溶液8 mL （0.8 mg/mL，用D-Hanks液配制），待胰腺充分膨脹后，剝離放入含10 mL膠原酶的離心管中，于37 ℃ 恒溫水浴中充分消化至乳糜狀后終止，輕輕搖勻，離心洗滌3次；加入10 mL Histopaque?-1119液，渦旋混勻，各5 mL D-Hanks液和Histopaque?-1077液貼壁輕輕加入上層，再次離心，留上清液和底部分離、洗滌、轉至培養(yǎng)皿，經過手工挑選，純化得到胰島。

1.3.2 胰島當量（islet equivalent, IEQ）的計算：參考FELDMAN等[6]制定的方法，并加以改進。吸取混懸后含有胰島細胞的50 μL組織溶液，并行雙硫腙染色，光鏡下標尺測量陽性細胞團直徑，并根據(jù)IEQ表換算為直徑相當于150 μm胰島的IEQ，再計算總1 000。總IEQ指含有胰島組織的混懸液中全部的胰島當量；3次胰島總當量指3次取樣的組織液中所含IEQ總和；樣品體積是指取樣前，組織混懸液體積。

1.3.3 胰島體外分泌功能的檢測：將獲取的胰島于37 ℃體積分數(shù)5% CO2條件下培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液后，分別用低葡萄糖（2.22 mmol/L）和高葡萄糖（22.2 mmol/L）進行培養(yǎng)，于37 ℃下將胰島細胞置于低葡萄糖或高葡萄糖培養(yǎng)液中靜止培養(yǎng)2 h，取上清液，于-20 ℃下保存。應用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒測定經2種濃度葡萄糖培養(yǎng)后的上清液中胰島素的濃度，同時計算刺激指數(shù)：刺激指數(shù)=高糖環(huán)境下胰島素的分泌濃度/低糖環(huán)境下胰島素的分泌濃度×100%。

1.3.4 造模：適應性喂養(yǎng)SD大鼠1周后，禁食12 h， 采用一次性腹腔注射鏈脲菌素50 mg/kg制備SD大鼠糖尿病模型。注射鏈脲菌素72 h后，每天采集大鼠尾靜脈血，測定隨機血糖，如連續(xù)3次血糖＞16.6 mmol/L，則確定成功建立大鼠糖尿病模型。糖尿病模型造模后定期監(jiān)測各組大鼠的血糖水平。

1.3.5 實驗分組：實驗共分4組，每組6只大鼠，分為正常對照組、假手術組、糖尿病組、糖尿病胰島移植組。糖尿病造模12周后，開始進行胰島移植，12只大鼠隨機分為糖尿病組、糖尿病胰島移植組。胰島移植4周（即糖尿病造模16周）后處死大鼠。

1.3.6 胰島移植：糖尿病造模12周后，胰島移植組大鼠采用吸入麻醉，右側背部切口，大鼠的右腎包膜下移植1 400當量的胰島。假手術組大鼠同期進行假手術處理。

1.4 檢測項目

1.4.1 足底痛敏反應時長實驗：第16周，將大鼠放在痛覺檢測板上，同時開始計時，直至大鼠開始舔舐足反應的時間作為該大鼠的足底痛覺反應時間。采用雙盲方法對每只大鼠重復實驗3次，每次間隔10 min，計算3次的平均值。

1.4.2 HE染色：將多聚甲醛固定的坐骨神經組織包埋、切片，組織切片依次在不同梯度的乙醇（100%、90%、80%、70%）中覆水。再用蘇木精染色，5 min后流水沖洗。此后用伊紅染色，1 min后流水沖洗。隨后在70%、80%、90%、100%乙醇梯度脫水，隨后在二甲苯中脫水30 s。滴上中性樹膠，封片后于鏡下觀察。

1.4.3 實時熒光定量PCR檢測：①RNA的提取：第16周，水合氯醛麻醉，處死動物后快速取出大鼠坐骨神經，立即-80 ℃保存；將-80 ℃保存的坐骨神經，置于冰上解凍，加入1 000 μL的TRIzol冰上裂解樣品；隨后加入200 μL三氯甲烷，靜置10 min后分層，12 000 r/min離心15 min；隨后吸取上清液，并與等體積的異丙醇混合，上下顛倒充分混勻后，冰上靜置10 min，隨后12 000 r/min繼續(xù)離心10 min， 棄上清液；經乙醇洗滌后獲得RNA粉末。②cDNA反轉 錄：將RNA粉末用DEPC水溶解，隨后用Takara的反轉錄試劑盒、Eppendorf的PCR儀將RNA反轉錄成為cDNA。③熒光定量PCR：接著使用QuantStudio Q3儀器進行實時定量PCR實驗。從生工生物工程（上海）股份有限公司設計合成并購買TNFα引物，檢測每個基因的相對表達量（以Actb為內參）。引物序列見表1。

表1 TNFα、Actb引物序列

1.4.4 蛋白質印跡法（Western blot）檢測：取100 mg坐骨神經，加入適量裂解液，冰浴充分裂解10 min，以12 000 r/min在4 ℃離心10 min，吸取上清液，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。隨后在蛋白樣本中加入蛋白上樣緩沖液，進行電泳、轉膜、封閉后，條帶分別與BCL-2、BAX、caspase3、GAPDH的一抗在4 ℃環(huán)境下的搖床孵育過夜。TBST洗膜，再加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育 1.5 h，TBST充分洗滌，用ECL化學發(fā)光試劑顯色后，化學發(fā)光儀成像。ImageJ軟件分析各條帶中目的蛋白的密度值后進行統(tǒng)計和分析。

1.5 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料均用±s表示。多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組間血糖比較 在糖尿病模型建立后、胰島移植以前，糖尿病組、糖尿病胰島移植組血糖較正常對照組、假手術組血糖水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。胰島移植3～5 d后，糖尿病胰島移植組大鼠血糖比糖尿病組大鼠明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。胰島移植2～3周后，糖尿病胰島移植組血糖較前升高，但與糖尿病組大鼠比仍明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖1。

圖1 各組大鼠血糖變化

2.2 各組大鼠坐骨神經HE染色比較 光學顯微鏡下觀察坐骨神經切片，可見正常組、假手術組大鼠坐骨神經纖維排列整齊，分布密集均勻，細胞結構完整；而糖尿病組大鼠的坐骨神經受到了嚴重的破壞，主要體現(xiàn)在神經纖維的損傷上，神經纖維形態(tài)不規(guī)則，結構不清楚，有髓纖維密度減少，神經纖維間隙擴大。糖尿病胰島移植組坐骨神經的損傷較糖尿病組有所改善，神經纖維變性、斷裂均有減少，但仍有一些神經斷裂與變性。見圖2。

圖2 各組大鼠坐骨神經HE染色

2.3 各組行為學比較 糖尿病組大鼠足底痛敏反應時間[（24.34±1.91）s]與對照組[（11.26± 1.26）s]、假手術組[（10.56±1.30）s]比均顯著延長，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；糖尿病胰島移植組痛敏反應時間[（16.18±1.20）s]較糖尿病組大鼠明顯縮短，但仍較對照組與假手術組長，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。

2.4 各組TNF-α mRNA的表達比較 糖尿病組（8.18±1.19）坐骨神經內TNF-α mRNA相對表達量較正常對照組（1.00±0.10）、假手術組（0.96±0.21）明顯上調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；糖尿病胰島移植組（5.39±0.95）坐骨神經的TNF-α mRNA相對表達量較糖尿病組明顯下調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.5 各組BAX、BCL-2、caspase-3蛋白的表達比較 與對照組、假手術組相比，糖尿病組大鼠坐骨神經BCL-2蛋白表達下調，促凋亡蛋白BAX明顯上調，伴caspase3表達的上調，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。胰島移植后，與糖尿病組比，糖尿病胰島移植組大鼠坐骨神經抗凋亡蛋白BCL-2表達上調，促凋亡蛋白BAX以及caspase3表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖3、圖4。

圖3 Western blot檢測各組大鼠BCL-2、BAX、caspase3蛋白電泳條帶圖

圖4 各組大鼠BCL-2、BAX、caspase3的蛋白相對表達量

3 討論

長期高血糖是DPN發(fā)生的主要危險因素，該過程錯綜復雜，高血糖引起缺血缺氧、施旺細胞凋亡以及炎癥反應等，從而加重DPN[5]。胰島素強化治療影響糖尿病患者的生活質量，且有發(fā)生低血糖的風險[6]。胰島移植目前被認為是1型糖尿病晚期病變的首選治療方式，并可改善糖尿病腎病、糖尿病心臟病變等并發(fā)癥[7]。目前鮮少有胰島移植對DPN影響的相關報道。

DPN的具體機制目前尚不明確，臨床和基礎研究均表明炎癥反應是DPN的重要病理生理過程[8]。近年來DPN的研究領域已從以血糖為中心的觀點發(fā)展到更深入、更廣泛的理解，即DPN是一個繼發(fā)于多個相關的代謝和炎癥損傷的復雜疾病[9]。

神經血管功能的異常，是DPN的重要致病機 制[10]。長期高血糖誘發(fā)炎癥反應的微環(huán)境，炎性因子浸潤血管周圍，抑制血管的功能和修復，引起DPN的神經血管功能的破壞；反之，炎癥反應的減輕可促進神經血管功能的恢復[11]。長期高血糖誘發(fā)炎癥反應，導致神經元結構改變、膠質細胞活化，引起單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞浸入中樞神經系統(tǒng)，并分泌炎性因子TNF-α，破壞髓鞘結構、增強神經細胞的興奮性，引起水腫并加重神經系統(tǒng)炎癥反應[12]。炎性因子TNF-α水平的升高亦引起細胞黏附分子表達增加，降低血液灌注，減少神經營養(yǎng)支持，加重DPN[13]。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠體內TNF-α水平明顯上升，敲除TNF-α基因可明顯改善DPN，認為TNF-α是DPN中重要的促炎因子[14]。抑制TNF-α亦可改善DPN，驗證了TNF-α在DPN中的致病作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠坐骨神經內TNF-α水平明顯升高，這與既往文獻報道一致，證明本研究糖尿病模型建立成功。胰島移植后糖尿病大鼠血糖降低、大鼠痛敏反應時間較糖尿病組明顯縮短，推測胰島移植可能是通過調控血糖，下調坐骨神經TNF-α的表達，增加神經營養(yǎng)的血供，減輕坐骨神經的髓鞘軸索脫失，改善神經營養(yǎng)支持，從而改善DPN。

此外，凋亡引起外周感覺神經元的脫失，亦是DPN的重要機制之一[15]。抗凋亡蛋白BCL-2直接抑制促凋亡蛋白BAX，并阻止BAX同聚物寡聚體的形 成[16]。血糖升高、炎癥反應引起B(yǎng)AX表達上調、線粒體膜通透性增加，引起細胞色素C釋放至細胞質，活化caspase3，最終引起細胞凋亡，這是DPN疾病進展的重要機制[15-16]。BCL-2是控制細胞凋亡的重要蛋白之一，BCL-2表達上調能明顯增加細胞的存 活[17]。Caspase3是最常見的一種半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，被多種上游凋亡途徑激活；線粒體的凋亡是由直接或間接激活或抑制半胱氨酸蛋白酶形成的蛋白來調控的[4]。高血糖引起線粒體功能異常，抗凋亡營養(yǎng)因子的缺失，胰島素、C肽及其受體的下調，從而引起程序性死亡[17]。凋亡應激通過增加促凋亡蛋白BAX表達，氧化性DNA損傷，以及多種上游caspase誘導caspase3活化[18]。本研究觀察到糖尿病組大鼠坐骨神經BCL-2表達下調，BAX、caspase3蛋白表達明顯增加，這與既往文獻報道的BCL-2/BAX、caspase3在DPN中的凋亡效應一致[19]。糖尿病胰島移植后，BCL-2表達上調，BAX、caspase3蛋白表達下調，說明胰島移植可能是通過調控血糖，減輕炎癥反應，減少TNF-α的分泌，上調抗凋亡蛋白BCL-2，下調BAX、caspase3，抑制細胞凋亡，增加細胞存活，從而改善DPN。

胰島移植對DPN的保護作用可能是通過調控血糖，抑制促炎因子TNF-α的分泌，上調抗凋亡蛋白BCL-2的表達，下調BAX、caspase3的表達，減輕周圍神經髓鞘脫失，縮短糖尿病大鼠的痛敏反應時間，但具體調控機制還需要進一步研究。腎包膜下胰島移植后，局部炎癥反應、排斥反應，導致胰島細胞的功能丟失，胰島移植2～3周，血糖繼續(xù)升高。本研究觀察時間較短，血糖相對穩(wěn)定，觀察到胰島移植通過血糖的調控、對周圍神經有一定的保護作用。DPN發(fā)病率高、致殘率高，目前仍缺乏有效的治療，本研究為DPN提供了新的治療方向。