成纖維細胞生長因子21參與調控非諾貝特對肝臟脂質代謝的改善作用

李丹，謝偉，于寧，郁瓊麗，施亞茹，張穎超，林灼鋒

溫州醫科大學 藥學院，浙江 溫州 325035

非諾貝特（fenofibrate, FF）是治療高脂血癥的常用藥物，主要通過抑制低密度脂蛋白（low density lipoprotein, LDL）、極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein, VLDL）和甘油三脂（triglyceride, TG）表達，提高高密度脂蛋白（high-density lipoprotein, HDL）水平發揮降脂作 用[1-2]。早期研究發現，FF能夠激活過氧物酶體增殖物激動受體α（peroxisome proliferatoractivated receptor-α, PPARα），并促進其下游脂蛋白脂肪酶相關基因的表達[3-5]。

成纖維細胞生長因子21（fibroblast growth factor 21, FGF21）是一種主要由肝臟表達分泌的代謝激素，具有調節葡萄糖和脂質穩態以及胰島素敏感性的多效性[6]。FGF21已被證明可以通過調控肝臟脂質代謝來調節小鼠機體脂質穩態[7-9]。FGF21在禁食期間被報道為PPARα多效性作用的介導者[10]， VERNIA等[11]闡明了機體肝臟FGF21和PPARα的表達相關性，并證明了PPARα通過激活JNK信號通路刺激FGF21的表達。然而，FF是否通過FGF21調控肝臟脂質代謝，仍有待于進一步探究。

本研究選取FGF21基因缺失小鼠及同窩野生型小鼠進行高脂飲食（high-fat diet, HFD）喂養誘導其形成肥胖小鼠模型，觀察FF改善肥胖小鼠機體脂質代謝的作用，探討FGF21基因是否介導FF改善肥胖小鼠肝臟脂質代謝。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物：8周齡SPF級雄性C57BL/6J FGF21基因缺失（FGF21 KO）小鼠及C57BL/6J WT小鼠由香港大學李嘉誠醫學院實驗中心提供，飼養于溫州醫科大學SPF級實驗動物中心，室溫維持在21～23 ℃，濕度40%～60%，12 h/12 h自然光交替照明，自由飲水飲食。

1.1.2 試劑與儀器：高脂飼料購于美國Open Source Diets公司；HE染色相關試劑購于北京索萊寶有限公司；FF及油紅染色相關試劑購于德國Sigma-Aldrich公司；TRIzol購于大連Takara公司，反轉錄試劑盒購于美國Invitrogen公司，One-Step RT-PCR試劑盒購于美國Thermo Scientific公司；FGF21及脂聯素（Adiponectin）ELISA試劑盒購于美國ImmunoDiagnostics Limited公司；TG和總膽固醇（total cholesterol, TC）檢測試劑盒購于美國Invitrogen公司。定量PCR儀購于美國Bio-Rad公司；熒光正置顯微鏡購于德國Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分組及處理：取FGF21基因缺失 （FGF21 KO）小鼠及同窩C57BL/6J野生型（WT）小鼠各10只，隨機分為4組，分別為：野生型對照組（WT+HFD+CTL組）、野生型FF治療組（WT+HFD+FF組）、FGF21基因敲除對照組（FGF21 KO+HFD+CTL組）、FGF21 基因敲除FF治療組（FGF21 KO+HFD+FF組）。給予4組小鼠HFD喂養4周，同時治療組以FF（150 mg/kg） 灌胃處理，對照組以相同體積的注射用水灌胃處理。4周后，處死小鼠，收集小鼠血清樣本、肝臟、皮下脂肪等組織用于后續實驗。

1.2.2 HE染色觀察肝臟組織形態學變化：肝臟組織樣本取出后，使用4%多聚甲醛進行固定，經過脫水、透明、浸蠟、包埋等操作后，切取5 μm厚的肝臟組織切片，制備成石蠟切片。切片干燥后，經脫蠟、乙醇梯度水化，通過HE染色，最后使用中性樹脂封片，鏡下觀察肝臟組織的形態學變化。

1.2.3 油紅O染色觀察肝臟組織脂質堆積情況：肝臟組織樣本取出后，使用4%多聚甲醛進行固定，OCT包埋，切取5 μm厚的肝臟組織冰凍切片。將切片放入預冷的80%丙酮中固定10 min；晾干后用純化水洗滌3次；切片滴加油紅O工作液染色6 min；純化水漂洗，依次置入60%異丙醇溶液I、II中各洗脫3 min；再次使用純化水漂洗；水性封片劑封片、鏡檢。

1.2.4 ELISA法檢測FGF21的水平：取小鼠血清稀釋2倍，根據廠家提供的說明書，采用定量夾心ELISA法，于450 nm處檢測樣品吸光度值，根據標準曲線計算樣本濃度。

1.2.5 ELISA法檢測Adiponectin的水平：取小鼠血清稀釋400倍，按照廠家提供的說明書，于450 nm 處檢測樣品吸光度值，根據標準曲線計算樣本濃度。

1.2.6 qRT-PCR檢測目的基因表達：使用TRIzol試劑提取肝臟及皮下脂肪組織中的RNA，超微量分光光度計檢測組織RNA含量。根據RNA反轉錄試劑說明書將其反轉錄為cDNA。設計小鼠PPARα、FGF21、膽固醇調節元件結合蛋白Srebp-2、乙酰輔酶A羧化酶α（acetyl coenzyme A carboxylase alpha, Acaca）、乙酰輔酶A羧化酶β（acetyl coenzyme A carboxylase beta, Acacb）、腺苷三磷酸結合盒轉運體G亞家族成員5（ATP-binding cassette transporter subfamily G member 5, ABCG5）、ABCG8、膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7 alphahydroxylase, Cyp7a1）、PPARγ、Adiponectin的mRNA特異性引物，以GAPDH為內參（由美國Thermo Fisher Scientific公司設計合成，見表1），進行PCR擴增，擴增體系為：5 μL 2×SYBR Green熒光定量試劑、1 μL引物（上、下游各0.5 μL）、3 μL反應緩沖液，以及1 μL待測樣品cDNA。PCR反應體系為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s， 72 ℃ 20 s，反復40個循環。

1.3 統計學處理方法 采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計學分析。所有實驗數據均采用±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FF對HFD喂養的WT小鼠和FGF21 KO小鼠機體組分的影響 結果表明，無論是WT小鼠還是FGF21 KO小鼠，在HFD飼養基礎上使用FF治療均能顯著抑制HFD引發的小鼠體質量增加，同時顯著增加小鼠的肝臟、腎臟比重，但小鼠的皮下脂肪、腎周脂肪、附睪脂肪比重顯著降低（P＜0.05）。此外，FF給藥可明顯降低WT小鼠的棕色脂肪比重（P＜0.01），而對FGF21 KO小鼠的棕色脂肪比重無影響（P＞0.05）。見表2。

表2 FF對高脂飲食的WT小鼠和FGF21 KO小鼠機體組分的影響（每組n=5）

2.2 FF對HFD喂養小鼠體內PPARα和FGF21水平的影響 qRT-PCR結果顯示，在HFD喂養條件下，與對照組相比，FF處理顯著上調WT小鼠肝臟組織的PPARα及FGF21 mRNA水平，差異有統計學意義（P＜0.05）；在FGF21 KO小鼠中，FF誘發的該效應在一定程度上減弱，見圖1。此外，FF處理刺激WT小鼠血清FGF21水平顯著上調（P＜0.05），見圖2。

圖1 各組小鼠肝臟組織PPARα和FGF21的mRNA表達水平

圖2 各組小鼠血清中FGF21含量

2.3 敲除FGF21減弱FF對HFD喂養小鼠血脂的改善作用 在HFD喂養條件下，FF給藥明顯降低WT小鼠和FGF21 KO小鼠的血清TG水平（P＜0.05），然而FGF21 KO小鼠的TG下降幅度明顯小于WT小鼠，差異有統計學意義（P＜0.05）。此外，FF給藥明顯下調HFD喂養的WT小鼠血清TC含量（P＜0.05），而FF引發的降低血清TC的作用在FGF21基因缺失后被完全抑制，見圖3。

圖3 各組小鼠血清TG和TC的含量

2.4 敲除FGF21減弱FF改善HFD喂養小鼠肝臟脂質沉積的作用 組織形態學HE染色結果顯示，HFD飼養4周后，對照組WT小鼠的肝臟組織均出現圓形中空的空泡。與對照組WT小鼠相比，在FF給藥4周后，肝臟組織的空泡數量明顯減少，肝細胞排列整齊；然而在FGF21 KO小鼠中，FF給藥處理后仍然可見較多的大空泡，見圖4。與組織形態學HE染色結果染色一致，油紅O染色結果顯示，HFD飼養4周后，對照組小鼠的肝臟組織出現不同密度的紅色脂滴；與對照組WT小鼠相比，在FF處理4周后，小鼠肝臟中的脂滴數量明顯減少；但FGF21 KO小鼠經FF處理后，小鼠肝臟組織的脂滴數量則無明顯變化。見圖5。

圖4 HE染色評價肝組織形態學改變（箭頭所示為肝組織空泡，×200）

圖5 油紅染色評價肝組織脂質堆積情況（×200）

2.5 敲除FGF21減弱FF加速肝臟脂質代謝調節基因表達的作用 與HFD喂養的WT小鼠相比，給予FF治療4周后，小鼠肝臟脂肪酸合成基因Acaca的mRNA表達水平無明顯變化，見圖6A。而小鼠肝臟Acacb的表達則明顯增加（P＜0.01）；然而在FGF21基因敲除后，Acaca的表達無明顯變化，而FF處理引發的Acacb上調幅度在一定程度被減弱，見圖6B。

在肝臟脂質轉運調控方面，與HFD喂養的WT小鼠相比，FF處理4周后，小鼠肝臟組織中膽固醇轉運調控因子ABCG5和ABCG8的mRNA表達水平顯著增加（P＜0.05）；然而在FGF21 KO小鼠中，FF對小鼠肝臟組織ABCG8的表達無明顯影響，但FF誘導的ABCG5表達增加現象在FGF21基因敲除后被顯著抑制（P＜0.01），見圖6C、圖6D。

在膽固醇合成及分解代謝方面，給予FF處理后，Srebp-2 mRNA表達水平明顯下降（P＜0.05）；而參與膽汁酸代謝和分泌的關鍵基因Cyp7a1 mRNA表達則明顯增加（P＜0.05）；然而在FGF21基因缺失后，FF引發的肝臟Srebp-2和Cyp7a1的表達變化幅度被明顯抑制（P＜0.01、P＜0.05）。見圖6E、圖6F。

圖6 qRT-PCR檢測各組小鼠肝臟組織中Acaca、Acacb、ABCG5、ABCG8、Srebp2、Cyp7a1的mRNA水平

2.6 敲除FGF21顯著抑制FF誘導的PPARγ和 Adiponectin表達上調 qRT-PCR結果顯示，在HFD喂養條件下，FF給藥明顯上調WT小鼠皮下脂肪組織的PPARγ及Adiponectin mRNA水平（P＜0.05），同時也顯著增加小鼠血清的Adiponectin循環水平（P＜0.01）。然而FGF21基因敲除后，FF處理引發的肝臟PPARγ和Adiponectin上調幅度均被顯著抑制（P＜0.05），血清Adiponectin上調幅度也被顯著抑制（P＜0.05）。見圖7。

圖7 qRT-PCR檢測各組小鼠皮下脂肪組織中PPARγ、Adiponectin mRNA水平及ELISA檢測各組小鼠血清中Adiponectin的變化

3 討論

FGF21是一種應激誘導激素，通過FGF受體1（FGFR1）和β-klotho構成的異二聚體受體復合物，在調節能量平衡和糖脂穩態方面發揮重要作用[12-14]。 作為FGFs家族非典型成員，FGF21能夠通過自分泌作用對肝臟組織進行脂質代謝調節[15-16]。既往研究表明給嚙齒動物或非人靈長類動物服用FGF21可減輕與肥胖有關的代謝并發癥，比如減少脂肪量、緩解高血糖、改善胰島素抵抗[17-18]，減輕血脂異常、心血管疾病和非酒精性脂肪性肝炎的病變情 況[17]。

FF是一種纖維酸衍生物，用于治療對非藥物治療無反應的患者的嚴重高甘油三酯血癥和混合性脂代謝紊亂，改善血脂異常患者的血脂水平（特別是TG和HDL水平）[11，19]，FF通過激活PPARα發揮調脂作用[20-21]。有研究發現，FGF21通過改善小鼠白色脂肪組織功能障礙，對FF介導的肥胖小鼠全身葡萄糖代謝的改善起重要作用[22]。然而FF與FGF21在調節脂質代謝方面的相關性研究少有報道，FGF21是否介導FF發揮其改善肝臟脂質代謝的作用有待于進一步探究。

本研究發現，FF刺激FGF21的循環水平增加，提示FGF21在FF改善機體脂質代謝過程中發揮重要作用。FF治療后可顯著改善小鼠脂質代謝，表現為改善小鼠血脂水平，減輕HFD引發的肝臟脂質沉積狀況。值得注意的是，FF對FGF21 KO小鼠的保護作用大大減弱。此外，FF處理顯著抑制膽固醇調節元件結合蛋白Srebp-2的表達，上調脂肪酸氧化基因Acacb，膽固醇轉運基因ABCG5和ABCG8、膽汁酸代謝基因Cyp7a1的表達，這表明在HFD喂養條件下，FF給藥可能抑制膽固醇合成，同時可能有助于促進小鼠肝臟脂質氧化代謝，加速脂質利用，進而減輕肝臟脂質沉積；而FGF21基因敲除后，FF對機體脂質代謝的改善作用明顯減弱。以上結果提示，FF發揮抗脂肪肝的生物學作用至少部分是通過上調FGF21的表達來實現的。Adiponectin在FGF21調控糖脂代謝過程中扮演重要角色[8]，它是PPARγ的下游效應物，并且是PPARγ激動劑噻唑烷二酮發揮胰島素增敏和保護血管等作用的重要介質[23-25]。那么，FGF21調控肝臟脂質代謝是否與Adiponectin相關有待于進一步探索。本研究檢測了各組小鼠機體的PPARγ和Adiponectin的表達水平，結果顯示FF刺激WT小鼠體內PPARγ和Adiponectin水平明顯上調，推測是由于FF刺激肝組織合成FGF21并將其分泌到循環系統，與脂肪組織中的受體結合從而激活PPARγ信號通路，進而上調Adiponectin的表達和分泌。有研究表明，脂肪組織在介導FGF21發揮降低TG作用方面是必需的[26]，Adiponectin缺乏導致FGF21對HFD誘導的高TG血癥的抑制作用受損[7]。與文獻調研結果一致，本研究結果表明：FGF21基因缺失后，FF刺激PPARγ及Adiponectin表達增加的現象被顯著抑制，同時，FF引發的降低血清TG的作用也被明顯減弱，提示Adiponectin在FGF21介導FF發揮抗脂肪肝作用中扮演重要角色。

綜上所述，在HFD喂養條件下，FF通過激活PPARα通路刺激FGF21表達增加，后者可能通過間接或直接的方式促進肝臟組織中脂肪酸燃燒來發揮其改善機體肝臟脂質代謝的生物學效應。