UPLC 同時測定丹參藥材中丹酚酸B 和丹參酮ⅡA 的含量分析

曹 莉

（鎮江市第一人民醫院藥劑科 江蘇 鎮江 212000）

藥材丹參的主要藥效成分為丹酚酸B（salvianolic acid B, SLB）和丹參酮ⅡA（tanshinone IIA, TNA）[1]。許多研究表明SLB 和TNA 可以改良心臟灌注功能，優化自由基侵蝕情況，這兩種物質可以在一定程度上反應丹參藥材的藥效情況。在藥典中，通過對SLB 和TNA 的含量情況進行控制來反映藥材丹參的質量程度。先前有研究使用HPLC 法檢測這兩種成分的含量，但由于此法較為耗時，當面臨較多檢測量時無法滿足測定要求。不同于傳統的HPLC 法，超高效液相色譜法（UPLC）具有較高的分離度和更快的分析速度。UPLC 法檢測藥材丹參含量相比于HPLC 法具有更大優勢。

丹參，是一種廣泛使用的中藥，用于治療冠心病、腦血管病、肝硬化和細菌感染。丹參是大量活性天然化合物的重要來源，這些活性天然化合物主要分為水溶性和脂溶性（二萜）組分。SLB 是丹參的主要水溶性提取物之一，TNA 是活性最高的二萜醌類色素[2]。兩者都因其廣泛的藥理活性而被廣泛研究。

1.儀器與試藥

采用Thermo Scientific Vanquish Horizon UHPLC 系統，UltiMate 3000 泵，UHPLC 自動進樣器，Vanquish ?柱溫箱，光電二極管陣列（PDA）檢測器以及Standard Instrument Integration（SII）管理軟件。SLB 和TNA 標準對照品來自于上海中藥標準化中心，純度＞99%。藥材丹參由安徽中醫藥大學陳亮鑒定為Salvia miltiorrhiza。

2.方法與結果

2.1 色譜條件

Accucore ? Vanquish ? C18+超高效液相色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.5 μm）流動相為Acetonitrile-0.1%Formic acid 水溶液，梯度洗脫，流速0.6 mL 每分鐘；檢測波長為280 納米，柱溫30 度。按照此條件對藥材丹參進行分離（R ＞2），對稱性佳（0.99 ～1.01）。

2.2 對照品溶液的制備

按照千分之一的準確度稱取標準對照品SLB 和TNA一定量，導入10 mL 容量瓶中，再導入濃度為75%的甲醇水溶液，震蕩溶解，再添加75%甲醇至容量瓶刻度線可得標準對照品溶液。

2.3 樣品溶液配制

按照千分之一的準確度稱取藥材丹參300 mg 倒入20 mL 試管中，震蕩溶解，稱重后補重。離心后取上清液再用甲醇稀釋。再度離心取上清液倒入容量瓶可得樣品溶液。

2.4 線性關系考察

按照千分之一的準確度稱取標準對照品一定量，采用75%甲醇進行稀釋，得到：SLB 溶液7.59，13.39，15.25，379，759 μg/mL；TNA 溶 液1.20，2.37，6.01，60.1，120 μg/mL 的標準對照品溶液。通過分開進樣3 μL，共三次進樣。按照質量濃度為X 軸，色譜峰面積為Y 軸，通過軟件計算回歸方程。SLB：Y = 11.89X+1.59，R = 0.9998；TNA：11.78X+4.97，R = 0.9997。 從 色 譜結果可以得出SLB 在7.59 ～759 μg/mL,TNA 在1.20 ～120 μg/mL 線性相關度良好。

2.5 精密度實驗

按照千分之一的準確度抽取標準對照品SLB 和TNA的混合溶液。反復進樣9 次，色譜結果表明SLB 和TNA的峰面積的相對標準偏差為0.09%和0.08%，精密度較好。

2.6 穩定性實驗

按照千分之一的準確度抽取樣品溶液3 μL，在一天內反復進樣12 次，評價藥材丹參的穩定性情況。結果顯示SLB 和TNA 的峰面積相對標準偏差低于0.3%，樣品溶液在一天內較為穩定。

2.7 重復性實驗

按照千分之一的準確度稱量300 mg 丹參藥材6 份，配制為樣品溶液，再行檢測。使用方程計算，結果顯示相對標準偏差為0.11%。表明本法有較好重復性。

2.8 加樣回收實驗

按照千分之一的準確度稱量丹參藥材150 mg，再加入SLB 和TNA 標準對照品一定量，并按照上述方案進行處理，在完成色譜分析后發現，測定均值和相對標準偏差為100.09%，0.43%；100.05%，0.79%。

2.9 樣品檢測

使用上述方案配制樣品溶液，并在上述各種條件下開展測定工作。記錄結果后使用方程計算SLB 和TNA 的含量情況，見表1。

表1 樣品中SLB 與TNA 的含量情況（mg/g）

3.討論

3.1 UPLC 與HPLC 的差異

高效液相色譜或高壓液相色譜是最流行、最現代、最強大和最通用的色譜分離技術之一，通常用于從復雜混合物（如草藥提取物或產品）中分離、鑒定和定量成分，并獲得粗混合物的化學圖譜或指紋圖譜。高效液相色譜可以說是定性和定量測定天然產品提取物、餾分或成品中化合物的最廣泛使用的分析分離技術。UPLC 是一種先進的液相色譜技術，具有分析時間短、流動相溶劑用量少的特點[3]。它還能提供更高的分離效率和分析物混合物的分辨率。UPLC 和HPLC 本質上是相同的技術，不應混淆為不同的技術。UPLC 儀器的主要特征是亞2 μm 的顆粒，而不是傳統的HPLC 系統中的2.5 ～10 μm 的顆粒。較小的顆粒（＜2 μm）需要更高的壓力才能工作，因此，UPLC必須能夠達到6 000 psi以上，這通常是HPLC的上限。

在UPLC 中，由于樣品粒徑較小（＜2 μm），樣品與固定相之間的擴散路徑較短，效率較高。最近引入的固體核心顆粒被包裹在小顆粒的表面，提供了更小的擴散路徑和更高的效率。UPLC 使植物化學家能夠比以前更快地解決與從各種基質中分離、檢測和定量各種次生代謝物相關的分析挑戰。在UPLC 中，運行時間可分別比使用3 和5 μm 色譜柱的HPLC 系統縮短3 倍和9 倍。UPLC 系統由于提高了信噪比，能夠在非常低的濃度下檢測分析物，并且需要的進樣量要小得多，而不會損失任何靈敏度。由于UPLC 與傳統的HPLC 不同的明顯優勢，UPLC 現在已經成為化學、生物醫學和藥物分析以及各種基質中植物化學物質分析的常規技術。

3.2 丹參的藥理學活性

丹參具有活血止痛的功效。其通過使用額外的機制，如抑制凋亡、抑制血小板脫顆粒、抑制肥大細胞脫顆粒、下調白細胞黏附分子的表達和抑制多種細胞因子如腫瘤壞死因子α（TNF-a）和白細胞介素等，丹參研究在預防缺血-再灌注相關的微循環障礙方面具有巨大的意義。研究表明，其主要活性成分TNA 能明顯減少腦缺血再灌注后炎癥介質的釋放，增強超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低丙二醛（MDA）含量，從而減輕腦水腫癥狀，有效減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷[4]。SOD 活性的水平間接反映了身體緩解自由基侵蝕的能力，而丙二醛的水平間接反映了機體的受創程度。研究顯示，TNA 能減輕大鼠的神經功能缺損癥狀，且隨著劑量的增加，神經功能缺損的減輕效果更加明顯。并且TNA 能降低大鼠腦梗死體積和腦含水量，不同濃度的TNA 能降低缺血再灌注組缺血半球額葉和頂葉皮質超氧化物歧化酶含量，增加丙二醛含量。研究表明，丹參客觀上對大鼠腦缺血再灌注損傷有保護作用。

丹參提取物增加內皮型一氧化氮合酶表達的作用在缺氧性肺動脈高壓中起重要作用，而增加內皮型一氧化氮合酶表達和磷酸化，誘導血管舒張和血壓降低。研究證明SLB 和TNA 顯著刺激了由鈉離子非依賴性系統y+載體介導的左旋精氨酸的攝取，這表明精氨酸通過質膜的轉運并沒有通過與鈉離子梯度的耦合而被激發。另有研究發現通過AMPK 途徑的一氧化氮合酶磷酸化外，SLB和TNA 還通過增加過氧化氫酶的表達來刺激左旋精氨酸的攝取。丹參可能在未來心肌缺血的治療中發揮關鍵作用[5]。然而，需要進一步研究丹參介導的一氧化氮產生的機制和觀察到的心臟保護作用。