半胱氨酸代謝途徑調控與腫瘤治療新策略

解 放，劉 楠

（中國藥科大學生命科學與技術學院，南京 211198）

自1920年奧托·瓦伯格發現瓦伯格效應，腫瘤代謝重編程的研究已經超過了一百年。腫瘤代謝重編程是腫瘤發生、發展過程中關鍵特征之一［1-2］。腫瘤細胞的快速增殖需要相應的能量和物質基礎，進而促進腫瘤生長。大量研究表明，除了糖代謝異常外，氨基酸代謝及脂質代謝異常也是腫瘤代謝重編程的重要研究范疇。本文將結合半胱氨酸在腫瘤細胞中的轉運方式和代謝途徑，分析半胱氨酸對腫瘤各個階段的調控機制，介紹相應的抗腫瘤靶向療法的最新進展。

1 半胱氨酸代謝途徑

近年來的研究表明，谷氨酰胺是潛在的腫瘤生物標志物［3-4］，精氨酸代謝則與腫瘤產生機制有關［5］，針對溶質載體家族6成員14（SLC6A14）的藥物α-甲基色氨酸可用于腫瘤靶向治療［6］。可見特定氨基酸代謝在腫瘤的發生發展、腫瘤微環境和腫瘤免疫治療等方面發揮重要作用。靶向腫瘤依賴性的氨基酸代謝，發展新型藥物，可有效抑制腫瘤的生長。半胱氨酸是一種非必需中性氨基酸，為三羧酸循環提供碳源，參與合成谷胱甘肽維持氧化還原平衡，同時其巰基可生成硫化氫促進ATP的生成［7］。腫瘤細胞自身轉硫途徑合成的半胱氨酸無法滿足其快速增殖的需求，要通過增加膜上的轉運體從胞外攝入胱氨酸。腫瘤細胞中半胱氨酸則主要來源于胱氨酸轉運體的轉運和內源性轉硫途徑的合成兩部分。

1.1 胱氨酸轉運蛋白家族

半胱氨酸在腫瘤細胞外主要以胱氨酸（Cys-SS-Cys）形式存在，經胱氨酸轉運體轉運至細胞內，由于細胞內呈高度還原狀態，胱氨酸被還原成半胱氨酸，參與合成谷胱甘肽（GSH）、硫化氫（H2S）、3-巰基丙酮酸、同型半胱氨酸等有機物，介導腫瘤的增殖、生長、轉移和耐藥［8-9］。胱氨酸/谷氨酸轉運體（System xc-）是由輕鏈SLC7A11（solute carrier family 7，member 1）和重鏈SLC3A2（solute carrier family 3，member 2）通過二硫鍵組成的異二聚體，在胰腺癌、結直腸癌細胞中高表達。輕鏈SLC7A11屬跨膜結構蛋白，N端和C端均位于細胞質內，其余部分穿梭于細胞膜。重鏈亞基SLC3A2負責維持System xc-的穩定性和膜定位。此外，SLC3A2還可與其他氨基酸轉運蛋白構成多聚體，如與SLC7A5共同組成氨基酸-多胺-有機陽離子轉運體，參與催化甲狀腺激素、藥物和激素前體的跨膜運輸［10］，調控Hippo和mTOR通路［11］。半胱氨酸也可藉由Na+依賴性的丙氨酸-絲氨酸半胱氨酸轉運蛋白SLC1A4、SLC1A5、SLC3A1和興奮性氨基酸轉運蛋白SLC1A1等非特異性轉運體進入細胞［12-13］，氨基酸轉運蛋白信息見表1。

表1 胱氨酸轉運蛋白列表

免疫組織化學實驗顯示，乳腺癌組織中SLC3A1表達量為癌旁組織的1.5倍，Kaplan-Meier生存分析發現，SLC3A1高表達的Ⅲ期患者生存率較低表達的患者減少20%，表明SLC3A1介導的半胱氨酸攝取促進乳腺癌進展［14］。SLC1A1的445位精氨酸突變為色氨酸和395位異亮氨酸缺失突變則降低SLC1A1對谷氨酸和半胱氨酸的轉運效率，導致二羧酸氨基酸尿癥。除這些中性氨基酸之外，SLC1A5高親和性地運輸L-谷氨酰胺和L-天冬酰胺，有助于維持神經元和神經膠質細胞的谷氨酰胺穩態［15］。在敲除SLC1A5的舌鱗癌SCC15和UM1細胞中，發現細胞攝取谷氨酰胺減少，裸鼠腫瘤生長受抑制，說明SLC1A5具有良好的抗腫瘤潛力，可作為口腔鱗狀細胞癌的新靶點［16-17］。

1.2 轉硫途徑

腫瘤細胞內半胱氨酸的水平不僅依賴于胱氨酸轉運蛋白的導入也與內源性轉化，即將甲硫氨酸轉化為半胱氨酸的轉硫途徑密切相關。轉硫途徑中，甲硫氨酸經S-腺苷甲硫氨酸、S-腺苷-L-同型半胱氨酸轉化成同型半胱氨酸，在胱硫醚-β-合成酶（cystathionineβ-synthase，CBS）催化下與絲氨酸縮合生成胱硫醚，再經胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionineγ-lyase，CSE）生成半胱氨酸，生成的半胱氨酸除了用于谷胱甘肽合成，還可用于含硫分子合成，經半胱氨酸雙加氧酶（cysteine dioxygenase，CDO）、半胱氨酸亞磺酸脫羧酶和次牛磺酸脫氫酶生成牛磺酸［18］，見圖1。

圖1 半胱氨酸代謝途徑

轉硫途徑與卵巢癌［19］、結腸癌［20］的能量代謝、腫瘤血管新生及腫瘤耐藥有關。GCN2-ATF4通路可根據細胞內空載的tRNA含量判斷氨基酸供應是否充足進而調控下游的轉錄因子ATF4的轉錄活性。Zhu等［21］通過染色質免疫沉淀發現半胱氨酸饑餓條件下，人惡性黑色素瘤細胞SKMEL30和人膠質母細胞瘤細胞LN229中，ATF4均與CBS和CSE的啟動子區域結合；使用CRISPR-Cas9技術敲除ATF4后，半胱氨酸饑餓時SKMEL30細胞中CBS、CSE的表達無明顯變化。用半胱氨酸饑餓處理SKMEL30和LN229，CBS、CSE、ATF4表達增加，GCN2磷酸化水平升高，表明在半胱氨酸饑餓下，GCN2-ATF4通路被激活，從而上調CBS、CSE表達，轉硫途徑占優。

CBS是抑癌因子HNF4α介導的肝癌上皮間質轉化抑制的主要效應物。單獨敲低半胱氨酸代謝途徑酶CBS和CDO1的肝癌細胞HepG2，E-鈣黏蛋白CDH1減少但波形蛋白VIM增加，誘導細胞遷移。說明轉硫途徑顯著抑制HepG2的上皮-間質轉化（EMT）和細胞遷移。培養基中回補代謝物牛磺酸、胱硫醚等，細胞遷移受到抑制。推測CBS活性增強后會調節4種主要代謝物（絲氨酸、胱硫醚、同型半胱氨酸和H2S）的含量變化，進而影響EMT和相關的耐藥性，并最終影響腫瘤的生長和進展［22］。然而CBS以及轉硫途徑調控腫瘤發生發展的作用并沒有明確結論，存在兩面性。Szabo等［20］采用敲低CBS或使用CBS抑制劑氨基羥乙酸AAOA處理人結腸癌細胞HCT116，顯著降低HCT116異種移植小鼠體內腫瘤的生長速率和體積，同時，降低腫瘤組織內CD31陽性血管密度血流量，抑制腫瘤血管新生。綜上說明與CBS相關的腫瘤發生發展根據腫瘤類型的不同，存在雙向性調控。

相較于胱氨酸轉運體介導的較單一內源性途徑，轉硫途徑涉及的化合物、酶和副產物眾多，在半胱氨酸代謝途徑調控中占據了主導地位，研究轉硫途徑中各類前體、代謝產物、副產物的產生和作用機制具有重要意義。

2 半胱氨酸代謝途徑在腫瘤發生發展中的調控作用

以半胱氨酸為中心的代謝網絡，涉及多種代謝物和酶參與氧化應激、能量代謝、細胞自噬的調控。研究半胱氨酸代謝調控腫瘤發生發展的機制，為開發和改進腫瘤診斷工具和腫瘤靶向藥物提供了可能性。

2.1 半胱氨酸代謝與氧化應激

氧化應激是腫瘤細胞重要的生物學特征之一。腫瘤細胞往往具有較高的活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，從而造成氧化應激。一定閾值的氧化應激可調節ROS參與激活細胞增殖、分化、衰老、轉錄因子調節等其他調節通路［23］，而在活性氧濃度急速升高等過度應激條件下，ROS打破細胞內氧化還原平衡，誘導細胞發生凋亡、壞死［24］。因此腫瘤細胞在較高ROS水平時，會激活細胞內抗氧化系統提高GSH的產生速率，以維持胞內的氧化還原狀態。

在腫瘤細胞中ATP依賴性的谷氨酸-半胱氨酸連接酶（glutamate-cysteine ligase，GCL）催化半胱氨酸與谷氨酸結合生成γ-谷氨酰半胱氨酸，谷胱甘肽合成酶（glutathione synthase，GS）催化甘氨酸與γ-谷氨酰半胱氨酸結合最終生成谷胱甘肽［25］。GCLM是GCL的調節亞基，基因敲除GCLM小鼠的定量代謝組學，發現GSH降低，谷氨酸和胱氨酸水平升高，抑制GSH的合成可導致活性氧積累，胃癌細胞死亡［26］。ATF3是ATF/CREB轉錄因子家族成員，可由DNA損傷、氧化應激和細胞損傷誘導激活。研究發現，在鐵死亡激活劑Erastin處理的人纖維肉瘤細胞HT1080中，ATF3表達增加，C11-BODIPY檢測的脂質過氧化物水平升高30%；敲除ATF3后，GSH水平提高［27］，全基因組芯片序列分析顯示，ATF3以p53非依賴性的方式與SLC7A11啟動子結合，并抑制SLC7A11的轉錄功能。說明氧化還原相關轉錄因子ATF3通過調控SLC7A11進而調節GSH，阻斷脂質過氧化過程以應對氧化壓力。通過闡明腫瘤細胞以調控半胱氨酸轉運能力來平衡細胞內氧化還原水平的分子機制，有望發現氧化應激相關的潛在靶點。

2.2 半胱氨酸代謝與能量代謝

腫瘤細胞需要一定濃度的NADPH以維持細胞內能量代謝平衡。與正常細胞類似，腫瘤細胞的NADPH來自于磷酸戊糖途徑和檸檬酸-丙酮酸循環，而脂肪酸、GSH合成等會消耗NADPH，并且在胱氨酸轉運進入細胞后，胱氨酸與消耗NADPH，生成NADP+和半胱氨酸。Liu等［28］發現，葡萄糖轉運蛋白GLUT的靶向抑制劑KL-11743處理肺鱗癌異種移植小鼠，KL-11743處理組磷酸戊糖中間體6-磷酸葡萄糖減少50%，高表達SLC7A11腫瘤中NADP+/NADPH比率顯著提高，說明高表達SLC7A11的腫瘤對GULT抑制更加敏感。同時，在腎癌786-O細胞中葡萄糖饑餓限制磷酸戊糖途徑，顯著提高胱氨酸饑餓敏感的胱氨酸水平，γ-谷氨酰胱氨酸（γ-glutamylcystine）等二硫化合物積累，NADP+/NADPH比率增加，可見胱氨酸和其他二硫化物的積累、NADPH耗竭、葡萄糖饑餓等多種原因共同引起腫瘤細胞死亡。說明通過耗竭胱氨酸代謝與能量代謝交點的NADPH可以促進腫瘤細胞發生能量紊亂，進而促進腫瘤死亡。

2.3 半胱氨酸代謝與細胞自噬

自噬是細胞在營養壓力、低氧應激條件下維持自身穩態的調節機制，主要通過泛素蛋白酶體和溶酶體兩種途徑，降解非必要組分以獲得氨基酸等營養物質和能量，是細胞對抗外界不利環境的自我保護手段。當半胱氨酸缺乏時，腫瘤細胞可藉由溶酶體途徑降解無用的蛋白質而獲得半胱氨酸，通過溶酶體胱氨酸轉運蛋白（cystinosin，CTNS）將半胱氨酸轉出溶酶體［29-30］，以在半胱氨酸缺乏的條件下獲得半胱氨酸。半胱胺是一種氨基硫醇類化合物，最初用于治療胱氨酸積聚于溶酶體導致的胱氨酸病，近年因具有可誘導形成自噬降解活性，而用于腫瘤治療［31］。Fujisawa等［32］發現，半胱胺可抑制人胰腺癌細胞MIA PaCa-2的遷移和侵襲，胰腺癌荷瘤小鼠給藥250 mg/kg半胱胺連續30 d，腫瘤轉移的總重量減少約90%。Andrzejewska等［33］通過免疫共沉淀和質譜檢測發現，CTNS與mTORC1信號通路的p18，p14和Mp1蛋白質相互作用。免疫熒光顯示在回補半胱氨酸后，敲除CTNS的腎外皮細胞中mTOR途徑仍處于下調狀態，說明CTNS在mTORC1信號通路中作用于Rags的上游。通過對CTNS進行干擾，實現從自噬通路mTOR途徑的源頭調節。

3 靶向半胱氨酸代謝途徑的腫瘤治療

抗腫瘤治療包括放療、化療和免疫療法等，但由于靶向性欠佳以及耐藥等問題，如何延長腫瘤患者生存期并提高生存質量已成為亟待解決的臨床難題。半胱氨酸代謝的多種酶和代謝物是潛在的治療靶點，研究半胱氨酸代謝途徑為腫瘤治療和新藥研發提供重要方向（表2）。

表2 靶向半胱氨酸代謝的腫瘤治療

3.1 靶向CSE的腫瘤治療

CSE是轉硫途徑生成半胱氨酸的關鍵酶，在腫瘤細胞增殖、遷移、遠端轉移方面發揮重要作用。Youness等［34］對80位乳腺癌患者活檢組織進行了qPCR分析，顯示乳腺癌組織中CSE的mRNA含量是同一患者正常乳腺組織的4倍，且高腫瘤增殖指數（Ki-67）中的CSE水平也相應增加。金精三羧酸選擇性結合CSE活性位點的Arg和Tyr殘基，抑制其活性。Wang等［35］對腫瘤基因組數據庫（The Cancer Genome Atlas，TCGA）的469份前列腺癌樣本和50份正常組織標本進行生物信息學分析，CSE在前列腺癌組織中呈高表達水平，8年隨訪的生存曲線表明，高表達CSE的患者生存率低于低表達組，低表達組生存期延長了20個月。胰腺癌和低度神經膠質瘤患者中也發現同樣規律。敲低CSE的前列腺癌細胞PC3，IL-1β減少，說明CSE通過抑制NF-κΒ-IL-1β介導的信號通路抑制侵襲。敲低CSE的PC3細胞原位移植到裸鼠上，60 d腫瘤體積約為未敲除組50%，主動脈淋巴結轉移發生率為40%，僅是未敲除組一半。雖然在不同腫瘤中都高表達，是一種潛在的腫瘤治療靶點，但針對CSE的抑制劑及治療方法尚處于實驗室研究階段。

3.2 靶向GPX4的腫瘤治療

谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）是含硒的磷脂過氧化酶，通過將脂質氫過氧化物還原為脂質醇，維持胞內的還原狀態，保護細胞免受脂質過氧化引起的鐵死亡。最新研究發現，皰疹病毒HSV-1感染的小鼠GPX4通過抑制細胞膜脂質過氧化激活cGAS-STING通路，GPX4失活則導致脂質過氧化產生，使得STING第88位半胱氨酸發生羰基化，抑制STING棕櫚酰化和由內質網向高爾基體的轉位［36］。雙敲除GPX4和KRAS的胰腺癌小鼠腫瘤轉移至肝和肺，轉移率為50%，而對照組轉移率為20%。敲除GPX4小鼠血清中DNA氧化損傷產物8-OHG增加，免疫熒光顯示胰腺癌小鼠組織中cGAS與DNA結合啟動STING依賴性反應，從而促進巨噬細胞浸潤和活化［37-38］。

烷化劑RSL3和ML162都是GPX4抑制劑，通過活化的烷基氯與催化中心的硒代半胱氨酸殘基共價結合。RSL3可以誘導順鉑耐藥頭頸癌HN3細胞發生內質網應激，通過PERK-ATF4-SENSN2途徑表達p62，細胞對化療藥物敏感性增加，敲低GPX4顯著提高了RSL3耐藥的HN3細胞對RSL3的敏感性［39］。ML162則使乳腺癌細胞GPX4活力降低50%。腫瘤內給藥每周50 mg/kg處理MDAMB-231原位乳腺癌小鼠2周，腫瘤重量較對照組減半［40］。但是這些烷化劑的藥代動力學性質不佳，穩定性差，ML210則是一種新型抑制劑，需在細胞內轉化為α-硝基酮肟JKE-1674，JKE-1674發生脫水反應生成不穩定的呋喃雜環，開環異構化生成選擇性結合GPX4硒代半胱氨酸殘基的腈氧親電體。與其他選擇性和穩定性較差的GPX4抑制劑不同的是，LC-MS監測小鼠經口給予ML210后24 h內血漿穩定性高達99%，全基因組CRISPR文庫篩選證明ML210具有更高的選擇性［41］。可見針對GPX4及其藥物篩選的研究將是未來新藥研發的重點之一。

3.3 靶向System xc-的腫瘤治療

System xc-屬于異二聚氨基酸轉運蛋白家族，由輕鏈SLC7A11和重鏈SLC3A2組成，負責將外源的胱氨酸轉運進入細胞，將細胞內等比例的谷氨酸轉運至細胞外。近年研究發現System xc-在非小細胞肺癌、口腔癌、前列腺癌、惡性神經膠質瘤等腫瘤中高表達，與腫瘤的增殖、侵襲、轉移和耐藥密切相關［42］。

免疫療法包括免疫檢查點的抑制劑與過繼細胞療法（CAR-T），在腫瘤免疫中得到廣泛應用，已成為腫瘤治療的支柱之一［43-44］。抗CTLA4的免疫治療激活CD8+T釋放IFNγ，放療和IFNγ聯合治療通過ATM和STAT1信號協同抑制從而下調System xc-的表達，大大減少人纖維肉瘤細胞中胱氨酸的攝取［45］。Wang等［46］發現，使用PD-L1抗體治療黑色素瘤小鼠，激活的CD8+T細胞通過IFNγ驅動脂質過氧化，從而造成脂質過氧化物在腫瘤細胞中積累，抑制System xc-的表達使腫瘤細胞發生鐵死亡。除免疫療法外，臨床使用索拉非尼、柳氮磺吡啶、蘭吡立松靶向System xc-治療前列腺癌、肝癌等疾病已見成效［47］。這提示靶向System xc-的腫瘤治療可以與免疫治療聯用，多類型藥物之間互為補充，增強靶向腫瘤細胞的精準程度。目前針對以System xc-為靶點的腫瘤免疫治療研究相對較少，針對System xc-的免疫應答進行深入的理論研究，有望為未來腫瘤研究提供新的方向。

4 總結與展望

半胱氨酸是一種生物體內常見的氨基酸，在氧化應激、能量代謝、細胞鐵死亡、細胞自噬方面發揮著重要作用。包含多種代謝產物和副產物的半胱氨酸代謝途徑促進或抑制腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲，為腫瘤研究提供了新的方向。通過調控半胱氨酸代謝網絡中的代謝物和酶，從而實現對腫瘤病理活動的調節，以此進行基礎理論研究發現潛在的藥物靶點，具有廣闊的前景和臨床意義。