槐定堿通過Wnt/β-catenin信號通路抑制人膠質瘤U87細胞遷移、侵襲

姜 羽 呂國偉 張文進 張 輝

膠質瘤是中樞神經系統最常見的原發性惡性腫瘤[1，2]。Wnt通路是細胞內一條在進化過程中高度保守的信號通路，分為4個分支，其中Wnt/β-catenin是經典路徑，在腫瘤細胞增殖、凋亡、間質轉化等多個方面具有調控作用[3，4]。研究表明，Wnt/β-catenin 通路的異常激活與膠質瘤等多種腫瘤有關[3，4]。槐定堿具有抗炎等藥理學活性[5]，對多種腫瘤細胞有調控作用[6，7]。本研究探討槐定堿對人膠質瘤U87細胞系的生物學行為產生影響，為膠質瘤的治療尋找新的有效藥物提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 將膠質瘤U87 細胞株（中國科學院上海細胞庫）于含10%胎牛血清和1%雙抗的1640 培養液（美國Invitrogen 公司）中培養，待細胞生長匯合度達到80%以上時進行傳代。以5×105個/孔密度接種于6 孔板培養16 h，加入槐定堿（上海將來實業股份有限公司，批號060736，純度＞99.0%），濃度分別為0 mg/ml（對照組）、1.0（低劑量）、2.0（中劑量）、3.0（高劑量）mg/ml，每個濃度設置6 個復孔，繼續培養24 h，光學顯微鏡下觀察細胞形態。

1.2 細胞遷移U87 細胞與槐定堿共培養24 h，不含胎牛血清的RPMI-1640 培養液中饑餓處理12 h；用10 μl 的移液槍頭垂直于板面劃痕，每4 h 觀察一次細胞遷移狀態，倒置熒光顯微鏡下拍照，作圖軟件處理，計算每組細胞24時和0時的劃痕寬度之比。

1.3 細胞侵襲U87 細胞與槐定堿共培養24 h，不含胎牛血清的培養基中饑餓處理12 h，胰蛋白酶消化后洗滌、離心，用不含胎牛血清的培養基重懸，調整密度約2×105個/ml；將Transwell 小室（上海Abcam公司）置于24孔板內，加入300 μl完全培養液，室溫下靜置30 min，使基質膠水化，向外室內加入500 μl完全培養液，將200 μl 細胞懸液接種于小室內，培養24 h，進行GISMA 染色，用棉簽擦拭小室內側，流水沖洗染液；用手術刀片將膜取下，置于載玻片上，于倒置顯微鏡下觀察、計數并拍照；每張玻片取上下左右中5個視野計數細胞，取平均數。

1.4 免疫印跡法檢測相關蛋白表達U87細胞與槐定堿共培養24 h，用RIPA 細胞裂解液裂解，提取蛋白質，凝膠電泳后，轉移至NC 膜，含5%脫脂奶粉的TBST 搖育封閉2 h，先后加入稀釋后的E-cadherin（1:1 000；美國Abcam 公司）、Vimentin（1:1 000；美國Abcam 公司）和基質金屬蛋白酶（matrix metallopro?teinase，MMP）-9（1:1 000；美國Abcam公司）一抗、二抗（1:5 000），TBST 洗滌NC 膜；ECL 顯色；將膠片掃描后用Bandscan5.0軟件進行灰度分析。

1.5 RT-PCR 檢測相關mRNA 水平U87 細胞與槐定堿共培養24 h，Trizol（美國Gibco公司）提取總RNA，行逆轉錄反應。取2 μl RNA進行PCR擴增：內參βactin 正義鏈5'-CTAGGCTAGCGCTAATCGAC-3'，反義 鏈5'-TCGGCATTTATTACGCTAGA-3'；Vimentin正義鏈5'-GCTTAGCGCCCTAGCTAGGCT-3'，反義鏈5'-TCGGCTTAGCCGATCGATC-3'；MMP-9 正義鏈5'-TAGCTTTCGTAGCCTAGCCT-3'，反義鏈5'-TAGGCTTCGTACGATAACGA-3'（上海生工生物工程有限公司合成）。擴增條件：94 ℃預變性2 min，1個循環；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35 個循環；72 ℃總延伸6 min。取5 μl PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，用圖像記錄分析系統對目的基因、參比基因的條帶灰度值進行分析。

1.6 統計學分析 用SPSS 19.0軟件進行分析；計量資料以±s表示，用多因素方差分析和LSD-t檢驗；P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 槐定堿對U87細胞形態的影響 對照組U87細胞為梭形間質細胞狀態，呈現上皮間質轉化（epitheli?al-mesenchymal transition，EMT）形態變化；中劑量槐定堿組呈現正常上皮細胞形態。

2.2 槐定堿對U87 細胞遷移和侵襲活性的影響 與對照組相比，槐定堿組U87細胞遷移、侵襲活性顯著降低（P＜0.001），且隨藥物濃度的增加，遷移、侵襲活性明顯降低（P＜0.001）。見圖1、2。

圖1 劃痕實驗檢測槐定堿對人膠質瘤U87細胞遷移能力的影響（40×）與0 mg/ml組相比，a P＜0.05；與1.0 mg/ml組相比，b P＜0.05；與2.0 mg/ml組相比，c P＜0.05

圖2 Transwell小室實驗檢測槐定堿對人膠質瘤U87細胞侵襲能力的影響（100×）與0 mg/ml組相比，a P＜0.05；與1.0 mg/ml組相比，b P＜0.05；與2.0 mg/ml組相比，c P＜0.05

2.3 槐定堿對U87 細胞β-catenin 和E-cadherin 蛋白表達的影響 槐定堿組U87 細胞β-catenin 蛋白表達水平顯著低于對照組（P＜0.001），且隨藥物濃度的增加而明顯降低（P＜0.001）；槐定堿組U87細胞E-cad?herin蛋白表達水平明顯高于對照組（P＜0.001），且隨藥物濃度的增加而明顯增高（P＜0.001）。見圖3。

圖3 免疫印跡法檢測槐定堿對人膠質瘤U87細胞β-catenin、E-cadherin蛋白表達的影響與0 mg/ml組相比，a P＜0.05；與1.0 mg/ml組相比，b P＜0.05；與2.0 mg/ml組相比，c P＜0.05

2.4 槐定堿對U87細胞Vimentin和MMP-9 mRNA和蛋白表達的影響 槐定堿組U87 細胞Vimentin 和MMP-9 mRNA 和蛋白表達這篇均顯著低于對照組（P＜0.01），且隨藥物濃度的增加明顯降低（P＜0.01）。見圖4、5。

圖4 免疫印跡法檢測槐定堿對人膠質瘤U87細胞Vimentin、MMP-9蛋白表達的影響與0 mg/ml組相比，a P＜0.05；與1.0 mg/ml組相比，b P＜0.05；與2.0 mg/ml組相比，c P＜0.05

圖5 RT-PCR 檢測槐定堿對人膠質瘤U87 細胞Vimentin、MMP-9mRNA表達的影響

3 討論

EMT 指源于上皮的腫瘤細胞失去極性，向具有間質表型細胞轉化的過程[8]。Wnt/β-catenin 信號通路的異常激活是導致EMT 的重要因素[3，8～10]，該信號通路與膠質瘤的發展有密切關系[11]。

槐定堿是中藥苦豆子的有效活性成分之一，能通過多種途徑抑制腫瘤細胞增殖、侵襲[5～7]。研究發現，槐定堿能通過抑制NF-κB介導的抗凋亡通路及激活Caspase 級聯反應，誘導膠質瘤細胞的凋亡[12]。另有研究證實，槐定堿能通過誘導ROS聚集，激活線粒體途徑而發揮抗腫瘤活性[13]。本研究發現，槐定堿能抑制膠質瘤細胞的遷移和侵襲。為了進一步探討槐定堿對膠質瘤U87 細胞可能存在的作用機制，我們進一步檢測了Wnt/β-catenin 通路中因子的表達。本研究發現，槐定堿能顯著抑制細胞內βcatenin 的表達，提示槐定堿可能對人膠質瘤細胞內Wnt/β-catenin 信號通路的活性具有抑制作用。βcatenin 參與膠質瘤細胞的增殖和侵襲過程的調控，當其表達被抑制后，膠質瘤細胞的增殖和侵襲相應受到影響[14]。

E-cadherin 是Wnt 信號通路中一個重要的因子，其表達缺失是EMT過程的重要標志[9，10]。可以通過恢復E-cadherin的表達而抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲活性[10，15]。本研究結果發現，槐定堿能有效促進細胞內E-cadherin 的表達，我們推測槐定堿對人膠質瘤細胞遷移和侵襲的抑制，與抑制細胞內Wnt/βcatenin 活性，同時刺激E-cadherin 表達而抑制EMT過程有關。在腫瘤細胞中，占主導地位的Ecadherin的表達降低能導致腫瘤細胞播散，同時能增加細胞內Vimentin 的活性[9]。Vimentin 主要作用在于調節細胞收縮、黏附和遷移，是EMT 途徑另一重要的蛋白之一[9，10]。本研究發現，槐定堿在促進人膠質瘤細胞內E-cadherin表達的同時，能抑制Vimentin的活性，我們推測槐定堿可能通過刺激人膠質瘤細胞內E-cadherin 表達，抑制Vimentin 的活性，而阻斷細胞內EMT過程，減弱細胞的遷移和侵襲能力。

MMP-9為Wnt 信號通路另一重要下游靶基因，為降解細胞外基質和基底膜的關鍵酶，也可以誘導EMT過程[16]。本研究發現，槐定堿能抑制MMP-9的表達，進一步說明槐定堿對人膠質瘤細胞遷移和侵襲能力的抑制作用與其對Wnt/β-catenin 信號通路活性的抑制作用密切相關。

綜上所述，槐定堿能抑制人膠質瘤U87 細胞的遷移和侵襲，機制可能是通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路的活性，阻斷EMT過程。