菌劑對苜蓿青貯發酵品質及微生物群落的影響

毛婷 牛永艷 鄭群 楊濤 穆永松 祝英 季彬 王治業

（1. 甘肅省科學院生物研究所 甘肅省微生物資源開發利用重點實驗室，蘭州 730000；2. 甘肅華瑞農業股份有限公司，張掖 734500）

被稱為飼草蛋白之王的紫花苜蓿是我國反芻動物的主要飼草來源，在我國東北、華北、西北等地區都適宜種植不同抗寒、耐鹽、高產、抗病品種的紫花苜蓿。紫花苜蓿蛋白質含量高、微生物及礦物質含量豐富、氨基酸平衡，是一種優良的保健飼料［1］。在苜蓿主產區，由于雨水與熱量同期，苜蓿收獲季節在制備苜蓿干草過程中容易受到雨水、落葉等損失，很難曬制成優質的干草，紫花苜蓿的青貯成為解決上述問題較為理想的途徑。紫花苜蓿屬于豆科多年生草本植物，可溶性碳水化合物及干物質含量低，在青貯過程中難以快速降低pH，減少梭狀芽胞桿菌生長、蛋白質水解和異氧發酵，提高青貯適口性［2］。因此，必需研究開發適宜于紫花苜蓿青貯的專一菌劑產品。

目前，關于菌劑產品的研究報道許多，市場上青貯的菌劑產品多樣，品質層次不一。青貯菌劑主要以乳酸菌菌株為主，添加多種功能性酶，具有添加量小、安全、易操作、無污染等優勢［3］；青貯密封后可以快速降低pH，減少蛋白質的分解；抑制青貯發酵溫度上升，減少干物質的損失；不宜發生二次發酵［4］。對于不同青貯原料開發不同青貯菌劑的研究報道有許多，俸祥仁等［5］以黑曲霉、乳酸菌及產軟假絲酵母復配青貯菌劑并運用于甘蔗葉梢青貯中。Fija?kowska等［6］采用3種不同乳酸菌作用于甜菜中提高青貯有氧穩定性，降低產毒真菌的濃度。Hager等［7］以植物乳桿菌和小球菌復配菌劑，以提高辣根草和甜高粱青貯的發酵品質。目前關于苜蓿等豆科植物單獨青貯的菌劑產品較少［8］。

綠汁發酵液是一種新型的乳酸菌類青貯菌劑，是將原料鮮草的汁液在厭氧條件下培養，富集原料上附著的野生乳酸菌中制備成棕色或棕黃色的液體［9］。綠汁發酵液中存在適宜于原料發酵所需的豐富的乳酸菌，Li等［10］報道了在38個苜蓿品種中分離得到84株乳酸菌隸屬于7個屬15個種及亞種。Chen等［11］研究了乳酸菌與纖維素酶聯合使用改善苜蓿青貯發酵品質，影響瘤胃發酵對動物生產性能產生積極影響。在苜蓿綠汁發酵液中分離篩選能在低碳水化合物下生長、產酸能力強的菌株可用于開發苜蓿青貯菌劑。研究表明，產酸能力強的乳酸菌株能快速的降低青貯pH值，為其他有益菌的生長提供酸性環境［12］；盧強等［13］研究發現在鹽堿地苜蓿青貯的微生物中，可能存在為數不多的藍細菌，并對鹽堿地苜蓿的生長發育產生促進作用。包維臣等［14］研究發現在苜蓿青貯中添加植物乳桿菌可以使乳酸菌活菌數快速升高，并對梭菌、大腸菌群、酵母菌和霉菌等青貯有害微生物產生了抑制作用。青貯過程是微生物群落結構復雜變化的過程。不同青貯添加劑的添加對微生物群落結構有著不同的影響。

有關青貯的研究多是從不同青貯原料、青貯條件等對青貯期間或開封后微生物的影響方面進行探討，較少將添加劑、青貯品質與微生物多樣性結合進行深入探討。本研究通過制備苜蓿綠汁發酵液分離篩選產乳酸能力強乳酸菌株并與實驗室前期分離得到的菌株復配制備苜蓿青貯菌劑，研究不同的青貯菌劑對紫花苜蓿青貯的發酵品質和微生物群落多樣性的影響，為青貯菌劑產品的開發提供理論依據與技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

紫花苜蓿來自于甘肅張掖華瑞農業股份在有限公司種植地。青貯試驗地位于張掖市民樂縣，E 100°22'-101°13'，N 37°56'-38°48'，海 拔2 309 m。試驗開展時間為2020年6月-9月，平均氣溫12℃-24℃，苜蓿原料有機組分如表1所示。

表1 紫花苜蓿鮮草的化學組成Table 1 Chemical composition of fresh alfalfa

1.2 方法

1.2.1 試驗處理 苜蓿收割后，放置田間晾曬1-2 d，用烘干法檢測水分含量為55%-60%。將晾曬水分含量為55%-60%的苜蓿切割為1-2 cm。4個處理組分別為：添加苜蓿綠汁發酵液（aFGJ組），添加進口菌劑貯生宜寶（YB組），添加復配菌劑GSSW（GSSW組）、及未添加菌劑作為對照（CK組），每個處理組9個重復。將處理后的苜蓿草裝入50 L食品級塑料桶內壓實封口后埋入地表下2 m貯存，樣品分別于30 d、50 d、70 d取樣檢測青貯的發酵特性和化學成分。對70 d的青貯微生物種群進行分析。

1.2.2 苜蓿青綠汁發酵液的制備 收集花蕾期苜蓿250 g，加入等量蒸餾水，在攪拌器中研磨攪拌，然后通過2層紗布過濾得到綠汁。將綠汁液500 mL藍蓋瓶中，加入2%葡萄糖，置于厭氧培養箱37℃厭氧培養箱中恒溫培養3 d得到苜蓿綠汁發酵液。采用梯度稀釋法測定活菌數。

1.2.3 乳酸菌株的分離與鑒定

1.2.3.1 乳酸菌株的分離 將苜蓿綠汁發酵液做標準10倍濃度系列梯度稀釋，分別取稀釋度為10-3、10-4、10-5、10-6倍的菌液100 μL涂于MRS篩選 培養基上，每個稀釋度做3個平行試驗，培養基倒置放入37℃厭氧培養箱中培養48 h后觀察菌落形態及是否產生鈣溶圈。用游標卡尺測量培養基中鈣溶圈直徑和菌落直徑，將兩者的比值記為Dd，選取比值較大的菌株進一步劃線純化3代獲得單菌落。

1.2.3.2 乳酸菌株的鑒定 利用微生物16S rDNA通用 引 物27F（5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'）、1492R（5'-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）對菌株16S rDNA序列進行擴增。菌落PCR條件：95℃ 5 min；95℃ 45 s，57℃退火50 s，72℃ 1 min，30循環；72℃延伸10 min。PCR產物純化回收后送至上海生物技術有限公司測序，利用BLAST軟件將測序結果與GenBank中已有序列進行比對，并建立系統發育樹，確定菌株的種屬。

1.2.4 青貯添加劑的特性 市售進口菌劑宜生貯寶（美國，成分：植物乳桿菌，乳酸片球菌，屎腸球菌，丙酸桿菌，枯草芽胞桿菌，黑曲霉；菌數：≧2.0×1010CFU/g）。按照說明書取0.1 g溶于200 mL水中，按規格均勻噴施于50 kg苜蓿上。產纖維素酶貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus belais）K1和產淀粉酶枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）J1保存于甘肅省工業微生物菌種保藏中心，保藏號分別為GSICC 42323和GSICC 78393。K1的羧甲基纖維素酶活性達到370 U/mL，J1的α-淀粉酶活性達到110 U/mL。將菌株K1，K2及在苜蓿綠汁發酵液中篩選到的乳酸菌按照1∶1混合，得到復合青貯菌劑GSSW。采用梯度稀釋法測定活菌數，青貯添加量為105CFU/g苜蓿。

1.2.5 苜蓿青貯樣品理化及發酵品質 pH值采用pH計檢測；氨態氮（ammonia nitrogen，NH3-N），總氮（total nitrogen，TN）采用凱氏定氮儀［15］；乳酸（lactic acid，LA）、乙酸（acetic acid，AA）及丁酸（butyric acid，BA）含量采用HPLC，KC-811離子色譜柱，柱溫50℃，流動相為3 mmol/L HCLO4溶液，進樣量5 μL［16］；干物質（dry matter，DM）含量測定采用105℃烘干恒質量法［17］；可溶性碳水化合物（water soluble carbohydrates，WSC）含量采用蒽酮-硫酸比色法［17］；粗蛋白含量=總氮×6.2；酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）、中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）及木質素（lignin，LN）含量的測定采用纖維素測定儀。

1.2.6 青貯樣品微生物多樣性分析 無菌條件下取苜蓿綠汁發酵液200 mL及發酵70 d苜蓿青貯樣品20 g與200 mL無菌生理鹽水混合，分別在37℃振蕩 2 h 制得菌懸液，無菌濾膜過濾獲得微生物菌體，每個樣品處理3個重復。按照Water DNA試劑盒步驟提取微生物總DNA。根據16S rDNA全長引物27F和1492R，合成帶有Barcode的特異引物，進行PCR擴增并對其產物進行純化、定量和均一化形成測序文庫（SMRT Bell）采用PacBio Sequel進行測序。將測序結果與 NCBI 基因庫比對，然后按照 97%相似性水平劃分操作分類單元（OTU），選取最優序列作為代表性序列，基于OTU分析結果，對樣品在各個分類水平上進行分類學分析，獲得樣品在門、綱、目、科、屬、種分類學水平上的物種分布柱狀圖［18］。利用QIIME軟件計算Alpha多樣性分析研究單個樣品物種豐度（richness）及物種多樣性（diversity）；Beta多樣性（beta diversity）分析比較不同樣品在物種多樣性方面存在的相似程度［19］。

1.2.7 數據分析 試驗數據經Excel 2007軟件整理并用SPSS 20.0軟件進行統計分析，結果用平均值±標準差表示。對不同處理組數據進行單因素和一般線性模型分析，P＜0.05代表差異顯著，P＞0.05代表差異不顯著。

2 結果

2.1 苜蓿綠汁發酵液中菌株的分離鑒定

根據MRS培養基上乳酸菌的菌落形態差異及鈣溶圈比值大小，挑選Dd比值較大菌株共得到3株，分別為MXLZ-1、MXLZ-2、MXLZ-4，Dd比值分比為8.82、8.39、7.29。通過PCR擴增菌株16S rDNA片段，測序結果經BLAST同源性分析，選取親緣關系最近的13個菌株序列，采用MEGA7.0構建系統發育樹，如圖1所示。從圖中看出菌株MXLZ-1、MXLZ-2及MXLZ-4的16S rDNA序列分別與小片球菌（Pediococcus parvulus）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）及戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）同源性≧99%。因此，菌株MXLZ-1、MXLZ-2及MXLZ-4分別鑒定為P. parvulus、L. plantarum及 P.pentosaceus。

圖1 菌株16S rDNA基因序列系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequence of strains

2.2 苜蓿青貯

在無菌條件下將菌株MXLZ-1、MXLZ-2、MXLZ-4分別接入100 mLMRS培養基，菌株K1、J1分別接入100 mL營養肉汁培養基培養，5種菌株發酵液按照1∶1∶1∶1∶1復配得到500 mL青貯菌劑GSSW。檢測GSSW青貯菌劑菌數為1.1×108g/mL。檢測苜蓿綠汁發酵液菌數為2.5×107g/mL。

2.3 苜蓿青貯營養成分變化

青貯時間及青貯添加劑對苜蓿營養品質的影響如表2所示。從表中可以看出，添加菌劑3組DM及CP含量明顯高于CK組（P＜0.05）；隨青貯時間的延長，4組DM及CP含量顯著降低；YB組30 d DM含量達到最高為324 g/kg FM，GSSW組30 d CP含量達到最高為274 g/kg DM；與發酵前原料相比，YB與GSSW組CP含量顯著增加。在青貯過程中WSC含量變化較大，發酵30 d、50 d時除CK組外，其余3個組WSC含量降低，70 d后WSC又有所升高，70 d時GSSW組WSC含量為67.8 g/kg DM，高于其他3個組（P＜0.05）。添加菌劑GSSW組及YB組ADF、NDF值顯著低于CK組，隨著青貯時間的延長，添加菌劑3組ADF及NDF顯著降低，而CK組無明顯變化，50 d后ADF及NDF降低速度緩慢，GSSW組及YB組苜蓿青貯NDF值分別為284、260 g/kg DM，ADF分別為314、323 g/kg DM；青貯過程中除YB處理組LN值明顯的降低外，其余3組無明顯變化。

表2 青貯時間和青貯添加劑對苜蓿營養品質的影響Table 2 Effect of time and silage additive on the nutritional quality of alfalfa silage

2.4 苜蓿青貯發酵特性及微生物的代謝產物變化

青貯時間及青貯添加劑對苜蓿發酵品質的影響如表3所示。從表中可以看出，除CK組pH降低速度較慢外，其余3個組pH在發酵50 d后都能快速的降到5以下；在青貯70 d后GSSW組、YB組 及aFGJ組pH值 分 別 為4.20、4.25、4.80，添加GSSW、YB可有效降低青貯pH值，提高青貯品質；GSSW組青貯pH的降低速度明顯高于aFGJ組。GSSW組氨氮/總氮含量明顯低于其他組；CK組氨氮含量明顯高于其他組。隨著青貯時間的延長，GSSW組乳酸含量呈現先降低后輕微升高，而乙酸含量降低的趨勢，在青貯50 d時，乳酸、乙酸含量分別為59.8、11.2 g/kg DM；YB組乳酸含量低于GSSW組而乙酸含量高于YB組；CK組在發酵30、50 d時乳酸含量無明顯的增加而在70 d后顯著增高（P＜0.05）；YB及GSSW組都未檢測到丁酸含量，aFGJ組檢測到丁酸含量明顯低于CK組（P＜0.05）。

表3 時間和添加劑對苜蓿青貯發酵品質的影響Table 3 Effect of time and silage additive on the fermentation quality of alfalfa silage

2.5 苜蓿青貯微生物群落分析

2.5.1 Alpha多樣性 不同處理組青貯樣品中的多樣性指數分析如圖2所示，Shannon稀釋曲線顯示曲線已經趨于平坦，其覆蓋度均達到99%以上，表明樣本測序量已經飽和，足夠反映樣本中絕大部分細菌物種的信息。

圖2 多樣本的香農曲線Fig.2 Multi-samples Shannon curves

2.5.2 Beta多樣性分析 不同處理組青貯樣品PCoA分析如圖3所示。3個重復的樣品點聚集在一起，表示3個樣品重復性好，PC1貢獻率為81.1%，PC2的貢獻率為10.7%。CK組落在第一象限，GSSW組和YB組樣品落在第二象限，和其他組樣品的距離相對較遠，GSSW組與YB組在物種上相似度較高。

圖3 多樣本的PCOA分析Fig.3 PCoA analysis of multi-samples

2.5.3 基于屬種水平細菌微生物群落結構分析 12個樣品測序后通過Barcode識別后共獲得89 997條CCS 序列，每個樣品至少產生7 387條CCS序列，平均產生7 500條CCS序列。圖中顯示豐度水平前十的物種，并將其他物種合并為Other在圖中顯示。不同處理組青貯樣品屬水平微生物群落結構如圖4-A所示，不同處理組青貯樣品屬種類和分布比例有顯著差異，4組屬水平豐度較高的屬均為Lactobacillis及Pediococcus；而添加3種菌劑的處理組，Lactobacillis豐度高于Pediococcus，CK組相反。不同處理組種水平微生物群落結構如圖4-B所示，圖中豐度大于5%的種中GSSW組微生物群落為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，92.95%）；YB組為植物乳桿菌（L. plantarum，85.50%）、戊糖 片 球 菌（Pediococcus pentosaceus，7.63%）；aFGJ組 為 植 物 乳 桿 菌（L. plantarum，50.55%）、戊糖 片 球 菌（P. pentosaceus，29.90%）、短 乳 桿 菌（Lactobacillus brevis，8.91%）；CK組為戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus，49.84%）、植物乳桿菌（L.plantarum，23.83%）、類腸膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides，9.71%）、蒙氏腸球菌（Enterococcus mundtii，6.04%）。

圖4 樣品屬種水平微生物群落結構Fig.4 Microbial community structure of samples on the genus and species level

不 同 處 理 組L. plantarum，P. pentosaceus，L.brevis及E. mundtii相對豐度差異顯著；添加3種菌劑的處理組L. plantarum 明顯高于CK組而P.pentosaceus明顯低于CK組；aFGJ組L.brevis明顯高于其他3組；在CK組中E. mundtii豐度明顯高于添加青貯菌劑的3組。

3 討論

3.1 苜蓿青貯菌劑的分類

青貯菌劑主要分為發酵促進型添加劑、發酵抑制型添加劑、好氧性變質抑制劑、營養性添加劑及吸附劑［20］。其中以乳酸菌類添加劑屬于發酵促進型添加劑，通過調節微生物的種類及數量從而促進其快速向低溫和低損失的發酵過程轉變。本實驗從綠汁發酵液中通過產酸能力強的3株菌株經16S rDNA檢測及系統發育樹構建確定為P. pentosaceus、L. plantarum及P. parvulus，這一結果與Li等［21］等報道的綠汁發酵液中乳酸菌株包括L. plantarum、L.casei、L. brevis及Streptococcus faecalis等結果相符。綠汁發酵液通常會促生原料上附著的野生乳酸菌株，更適宜于苜蓿青貯。目前市售的青貯菌劑中除乳酸菌外還添加纖維素酶、淀粉酶等或產酶的芽胞桿菌菌株，Bai等報道［22］在苜蓿青貯中添加產生抗菌肽的B. subtilis可以改善青貯發酵品質，提高有氧穩定性。Rychen等［23］報道了在一定劑量下添加解B.belais可以改善青貯有氧穩定性。因此，在GSSW菌劑中，除了添加來自綠汁發酵液中高產酸野生乳酸菌株外還添加了實驗室前期分離得到的產纖維素酶的B. belais K1及產淀粉酶的B. subtilis J1，調節苜蓿草營養成分及微生物的代謝組成。

3.2 苜蓿青貯營養及發酵品質

青貯過程是一個復雜的微生物活動和生物化學變化問題，原料成分會隨著發酵不同階段微生物的生長而成變化。隨著青貯時間的延長，植物體類一系列的酶促反映都會造成蛋白質的水解。70 d時GSSW組WSC含量高于其他3個組，菌劑的添加可以促進飼草中纖維素類物質的分解釋放出可被乳酸菌利用的糖，增加可發酵底物的量；青貯菌劑GSSW及YB組的添加可以提高原料中粗蛋白含量，快速降酸，減少干物質及粗蛋白的損失，這一研究結果與Li等［24］報道的內容一致。GSSW及YB組pH明顯低于CK及aFGJ組，菌劑的添加可以快速降低青貯PH，這與Mariott等［25］的研究結果相同。有機酸的總量及構成可以反映青貯發酵品值，優質青貯飼料乳酸含量＞50 g/kg DM，并占總有機酸60%以上；乙酸含量10-40 g/kg DM；丁酸含量越少或不含丁酸。GSSW及YB組乳酸含量明顯高于CK組，菌劑的添加不僅可以使青貯早期產生較多酸，在青貯后青貯飼料中乳酸含量也高于一般青貯飼料，而丙酸乙酸含量明顯降低。優質的苜蓿青貯飼料氨態氮/總氮的比例應＜15%。GSSW組氨氮/總氮含量明顯低于其他組，菌劑的添加可以減少蛋白質的分解，降低氨態氮/總氮含量，這一結論與Liu等［26］的研究結果一致。GSSW及YB菌劑的添加對于調整苜蓿營養成和改善發酵品質有著顯著地作用。

3.3 苜蓿青貯微生物群落結構

在苜蓿青貯過程中微生物的組成與發酵產物的生產、青貯組分變化、青貯的品質優質密切的關系。研究表明青貯發酵品質與發酵過程的微生態演變密切相關［27］。4個處理組發酵70 d苜蓿青貯樣品中豐度較高的屬為Lactobacillis、Pediococcus、Weisella及Enterococcus，這與Tohno等［28］報道的青貯有關乳酸菌等相一致。GSSW組種水平乳酸菌株有植物乳桿菌（L. plantarum，92.95%）、戊糖片球菌（P.pentosaceus，2.36%）與GSSW菌劑中的菌株相符，說明GSSW菌劑中菌株可以在苜蓿青貯中大量繁殖，適宜于苜蓿青貯并發揮重要作用。GSSW菌劑復配時添加了芽胞桿菌屬菌株，但在青貯發酵70 d后未檢出，分析原因為發酵70 d已進入發酵穩定階段，厭氧條件下不適宜芽胞桿菌屬菌株生長，芽胞桿菌屬菌株主要是在青貯初期好氧發酵階段進行繁殖。

添加菌劑處理組L. plantarum 明顯高于CK組而P. pentosaceus明顯低于CK組；L. plantarum屬于兼性異型發酵乳酸菌，相比于異型發酵乳酸菌可以更好地利用原料中的營養物質，減少營養成分的損失。GSSW組相比于其他組L. plantarum相對豐度越高，產酸速度快，乳酸含量高，pH值降低，減少蛋白質的分解，降低氨態氮含量，這一結果與GSSW組營養及發酵品質數據相對應。青貯70 d樣品中，添加GSSW菌劑及進口菌劑YB組pH值分別為4.20、4.25，明顯低于CK組，乳酸含量分別為44.5 g/kg DM、52.3 g/kg DM，明顯高于CK組。Zhao等［29］報道L. plantarum是青貯中重要菌株，可以快速產酸，為其他乳酸菌的生長提供酸性環境。GSSW組及YB組微生物群落結構中L. plantarum均占主要優勢，而在自然青貯條件下P. pentosaceus占主要優勢，這一實驗結果也驗證了L. plantarum對青貯pH，乳酸含量影響顯著。不同菌劑處理組中L. plantarum / P.pentosaceus值為GSSW組＞YB組＞aFGJ組，乳酸含量為GSSW組＞YB組＞aFGJ組，而pH及氨氮/總氮 為aFGJ組＞YB組＞GSSW組。L. plantarum / P.pentosaceus值與青貯乳酸含量呈正相關，與pH及氨氮/總氮呈負相關，比值越高，青貯品質越佳。E.mundtii在CK組中相對豐度明顯高于添加菌劑3組，E. mundtii在發酵初期與乳酸菌競爭可溶性碳水化合物，減緩青貯的酸化，因此，CK組青貯品質低于添加菌劑3組。正是由于發酵過程中有益乳酸菌群占據優勢主導地位，生成一定量的乳酸從而使pH值快速下降，才使得上述腐敗菌被有效抑制，從而更好地保存發酵原料的營養物質，青貯中微生物的種類及數量對于青貯品質有著顯著地影響。

4 結論

添加青貯菌劑均能增加有益菌的數量，減少有害菌數量，改善苜蓿青貯發酵品質。苜蓿青貯中L.plantarum及 P. pentosaceus的含量及比值對青貯優良發酵品質和組分變化起著重要作用。GSSW菌劑處理后青貯苜蓿品質優于與市場在售菌劑YB，可運用于苜蓿青貯。