水稻與稻粒黑粉病菌互作分子機制研究進展

蔣鈺琪 舒新月 鄭愛萍 王愛軍

（四川農業大學農學院，成都 611130）

水稻不育系在高產優質雜交稻選育中發揮關鍵作用，是水稻高產的關鍵種質資源［1-2］。稻粒黑粉病由擔子菌門真菌Tilletia horrida侵染引起，主要危害水稻不育系花器官［3-4］，在世界雜交稻制種田中廣泛分布。該菌厚垣孢子抗逆性強，在土壤和寄主種子中可長時間存活［5］。當環境條件適宜時，厚垣孢子萌發產生彈射能力較強的針狀或香蕉狀次生擔孢子侵染寄主［6］，隨后在穎殼內產生大量的黑色粉狀冬孢子影響水稻產量與質量［7-8］。以往認為該病發病率較低，對水稻生產影響有限，并未引起足夠的重視［9-11］。目前，為了提高雜交稻制種產量，新選育的不育系柱頭外露率增加，為稻粒黑粉病菌侵染提供了有利的宿主條件，導致該病害發生率逐年加重，已演變為威脅雜交稻高產優質的主要病害之一［12-13］。因此，研究稻粒黑粉病菌與寄主互作機制，進一步防控該病害的發生，對保障糧食安全生產具有重要的意義。

自Takahashi［14］于1896年報導稻粒黑粉病以來，國內外學者先后就其侵染細胞學開展了一系列研究［15-17］，然而稻粒黑粉病菌與水稻互作機制研究較少，尤其是稻粒黑粉病抗性基因尚未見報道。本文綜述了近年來稻粒黑粉病菌侵染過程、基因組學以及與水稻分子互作的最新進展，并提出了下一步研究的重點方向。以期為解析稻粒黑粉病菌致病機制、挖掘潛在的抗性基因；進一步通過分子育種手段培育抗病水稻不育系新材料奠定一定的理論基礎，保障水稻產業的可持續發展。

1 稻粒黑粉病菌侵染過程

稻粒黑粉病菌主要侵染水稻不育系的柱頭、雄蕊、漿片和雌蕊等花器官［3-4］。在開閉穎后，則主要侵染柱頭的外露部分。當不育系受精后，才能形成具有黑色粉狀物的病粒（圖1）［9］。水稻開花初期發生侵染，盛期受害最重?；ㄆ诜稚?、張穎角度大、柱頭外露率高的不育系較容易發生侵染，且柱頭活力強弱與病原菌侵染顯著相關［18-20］。此外，高溫多雨天氣、過多施用氮肥、趕花粉、使用生長激素也利于病原菌侵染寄主［21］。病原菌形態特征方面，王愛軍等［6］對稻粒黑粉病菌菌落、冬孢子及次生小孢子形態進行了觀察，人工培養基上初期呈酵母狀的白色菌落（圖2-A），后菌落面積增大，中間隆起，顏色由乳白色變為中間顏色較深的奶酪色，表面產生輻射狀褶皺（圖2-B）。其冬孢子呈球形或橢圓形（圖2-C），次生小孢子形態為線狀和彎曲狀（圖2-D），單細胞核（圖2-E）。

圖1 水稻稻粒黑粉病癥狀Fig.1 Symptom of rice kernel smut

圖2 水稻稻粒黑粉病菌形態特征Fig.2 Morphological characteristics of rice T. horrida

有關稻粒黑粉病菌侵染過程，國內學者做了些細胞學觀察［15-17］。王中康等［22］對接種稻粒黑粉病菌組織切片進行了觀察，結果表明病原菌擔孢子從花柱進入子房，進而擴展到珠心組織，后在糊粉層細胞或細胞間形成近圓形的冬孢子。陶家鳳等［16］分別對4個不育系珍汕97A、D90A、G46A和K17A接種稻粒黑粉病菌，觀察到病菌菌絲直接侵染柱頭，后擴展到子房的珠心組織，于接種8 h后在子房中發現了病原菌菌絲，第7天在種皮和糊粉層間形成了初生冬孢子，第9天冬孢子成熟，病菌在4個不育系材料中的浸染過程相似，且無需授粉就可以浸染，但只在胚乳能正常發育的子房中形成冬孢子［15］。此外，相關研究表明稻粒黑粉病菌侵染水稻花器官初期并不會破壞組織細胞，沒有明顯癥狀；近黃熟期才能出現明顯的黑色粉狀物。這為進行病害早期監控，及時提出防控措施帶來了一定的困難。在后續的研究工作中，可進一步對優化稻粒黑粉病早期檢測手段進行研究。

2 稻粒黑粉病菌的致病分子機制

作為活體營養型真菌，稻粒黑粉病菌在人工培養基上生長緩慢，平均生長速率為0.13 cm/d；且田間接種較為困難，在一定程度上阻礙了其致病機理的研究。稻粒黑粉病菌強毒力菌株JY-521的全基因組測序組裝完成［23］，為研究其效應蛋白提供了數據基礎，并為通過病原菌效應蛋白挖掘寄主抗性蛋白奠定了重要的理論基礎。

2.1 稻粒黑粉病菌全基因組測序完成

全基因組測序組裝是從分子水平上闡明病原菌致病機制的前提。Wang等［24］使用第二代基因組測序技術對稻粒黑粉病菌菌株QB-1進了基因組測序組裝，獲得約20 Mb的基因組草圖，預測獲得9 038個基因，其中4 650個基因用NR庫進行了注釋。Wang等［23］進一步結合第二代和第三代基因組測序技術對稻粒黑粉病菌強毒力菌株JY-521進行了精細測序，組裝出全長為23.2 Mb的基因組框架圖，預測獲得7 729個基因。此外，還對另外6個不同地理來源的稻粒黑粉病菌菌株進行了基因組重測序，并檢測到了豐富的遺傳變異。

進化分析表明，稻粒黑粉病菌與大麥堅黑粉菌（Ustilago hordei）具有較近的親緣關系，但兩者之間不存在明顯的共線性。對碳水化合物酶、次生代謝產物及分泌蛋白編碼基因進行了注釋，結果表明稻粒黑粉病菌基因組中編碼碳水化合物酶及次生代謝產物相關基因較少，可能反應了其獨特的活體營養型寄生方式，這一結果與活體營養型真菌稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）基因組注釋結果相似［25］。在預測的597個分泌蛋白編碼基因中發現，366個編碼小片段分泌蛋白（＜400氨基酸）的基因。此外，植物-病原互作蛋白數據庫比對分析表明1 697個蛋白編碼基因與病原菌致病性相關?；诒容^和功能基因組學分析，稻粒黑粉病菌全基因組測序的完成為揭示其進化、致病分子機制研究及進一步有效防控該病害提供了重要信息。

2.2 稻粒黑粉病菌致病機制研究

與稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）和白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae）等水稻病原菌相比，稻粒黑粉病菌田間接種及遺傳轉化較為困難，其致病機制研究進展緩慢。病原菌在侵染寄主早期，往往誘導其致病基因的上調表達。舒新月等［26］對稻粒黑粉病菌侵染感病水稻不育系材料9311A的5個時間點（8、12、24、48和72 h）轉錄組進行了分析，發現有500個基因在不同的侵染時間點被誘導差異表達，且在侵染8 h差異表達基因數最多。其中，有131 個編碼小分泌蛋白基因在侵染8 h被誘導上調表達，這些基因預測為候選效應蛋白。差異基因GO（gene ontology）和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）富集分析表明，脂類降解（lipid degradation）和自噬過程（autophagy processes）是稻粒黑粉病菌成功侵染寄主的關鍵生物學途徑。為稻粒黑粉病菌致病機制研究提供了參考。

植物病原真菌分泌的效應蛋白在植物與病原菌互作過程中發揮重要的作用［27］。多數編碼小分子分泌蛋白，通過誘導改變寄主細胞結構或功能，干擾寄主免疫，從而促進病原菌侵染［28-29］。Wang等［30］從預測的131個稻粒黑粉病菌效應蛋白中選擇36個在煙草表皮細胞中進行了瞬時表達，發現 smut_2965和smut_5844可誘導煙草表皮細胞死亡，并激活煙草免疫反應。預測的信號肽是smut_5844引起煙草表皮細胞壞死反應能力是必須的，而預測的核糖核酸酶活性位點是smut_2965所必須的。這為稻粒黑粉病菌致病機制研究提供了新的視角。為進一步明確smut_2965和smut_5844在稻粒黑粉病菌致病過程中的作用，還需結合基因編輯技術敲除稻粒黑粉病菌目的基因，并驗證其對病原菌毒力的影響。

上述研究為稻粒黑粉病菌致病機制的解析奠定了重要的基礎。但是，由于稻粒黑粉病菌生長周期較長，研究其功能基因難度較大；稻粒黑粉病菌侵染初期不顯癥，季節、氣候等因素對病原菌侵染影響較大，給田間菌株致病性檢測帶來了一定的困難；此外，稻粒黑粉病菌基因編輯體系尚不完善。這些原因導致了稻粒黑粉病菌致病機制研究進展緩慢。盤林秀等［31］對稻粒黑粉病菌不同菌株、不同生活史階段和不同濃度 Basta 處理下的最佳內參基因進行了篩選鑒定，發現UBQ、GAPDH 和 EF1α為不同條件下的最穩定內參基因，為稻粒黑粉病菌致病基因在侵染時的表達模式研究奠定了重要基礎。今后研究中，進一步完善稻粒黑粉病菌的接種方法和功能基因編輯體系至關重要，可為闡明稻粒黑粉病菌致病機理、制訂有效的防控策略提供新的思路。

3 水稻抗稻粒黑粉病研究

應用和選育抗病水稻不育系是防控稻粒黑粉病最為經濟、有效的手段，而關于稻粒黑粉病抗性水稻不育系資源及抗病基因報道較少。在稻粒黑粉病防控方面，Chen等［32］通過設計特異性ITS引物，可在病原菌侵染早期檢測到稻谷中的黑粉病菌，便于及時做出相應的防控措施，克服了稻粒黑粉病菌侵染早期不顯癥的問題。邵見陽等［17］用4個稻粒黑粉病菌菌株分別接種了2個水稻不育系材料，發病結果表明4個菌株沒有對某一個不育系表現親和或不親和性。該結果說明稻粒黑粉病菌沒有明顯的生理小種分化，為抗病水稻不育系田間接種鑒定奠定了重要的基礎。王愛軍等［33］對來源于我國福建、四川和湖北3省的78個水稻不育系材料進行了抗稻粒黑粉病評價，獲得了4個表現中抗水平以上的水稻不育系材料4766A、江城3A、巨豐2A和天豐A，為稻粒黑粉病抗性研究提供了重要的抗源材料。

寄主植物與病原菌互作過程中，病原菌通過侵入、增殖和移動擴散完成對寄主的侵染；植物感知病原菌進而激活一系列的防御反應，減緩病原菌的侵染［34］。稻粒黑粉病菌強毒力菌株JY-521分別侵染抗病不育系江城3A和感病不育系9311A，在侵染8、12、24、48和72 h取樣進行轉錄組分析。結果發現抗病水稻不育系中有更多的基因被稻粒黑粉病菌侵染誘導差異表達，表明稻粒黑粉病菌的侵染激活了抗病不育系的多個生物學途徑［24，35］。在侵染早期（8 h），抗病不育系中類鈣調蛋白（calmodulinlike proteins）編碼基因OsCML7和OsCML14；參與活性氧（reactive oxygen species，ROS）爆發的谷胱甘肽S-轉移酶（glutathione S-transferase）編碼基因Os09g0467200、Os01g0369700和Os01g0949800；NADPH 氧化酶基因Osrboh9以及水楊酸（salicylic acid，SA）信號途徑相關基因OsNPR1等多個基因被誘導上調表達。此外，病程相關蛋白（pathogenesisrelated proteins，PR）是植物受病原菌侵染誘導產生的一類蛋白，參與植物的誘導抗病性。轉錄組和熒光定量PCR分析表明，PR1a 和PR10b 也在稻粒黑粉病菌侵染抗病不育系早期被誘導上調表達。這些結果表明稻粒黑粉病菌侵染水稻初期就激活了水稻的基礎防衛反應［35］。

稻粒黑粉病菌主要侵染水稻不育系的花器官?？垢胁挥当容^轉錄組分析發現，抗病不育系中水稻穎花開花調節基因OsCTR2、OsABF1和OsRR1被稻粒黑粉病菌侵染誘導差異表達，而在感病不育系中這3個基因不呈差異表達。先前研究表明OsRR1和OsCTR2 的過量表達株系表現晚花表型［36-37］。在侵染12 h時，抗病不育系中這兩個基因被誘導上調表達。OsABF1是1個開花期的負調控因子，干涉表達株系表現延遲開花表型，與此對應抗病不育系中該基因被稻粒黑粉病侵染誘導下調表達。這些結果表明誘導晚花可能是稻粒黑粉病抗性的潛在機制［38］。為稻粒黑粉病抗性機制解析提供了理論基礎。

此外，抗感水稻不育系轉錄組分析發現，有4 425個基因在抗病不育系中被稻粒黑粉病侵染誘導差異表達，而在感病不育系中不呈差異表達［35］。這些基因可能是參與稻粒黑粉病抗性調控的關鍵基因。在以后的稻粒黑粉病抗性基因克隆工作中，可將重點集中于這類基因。該結果為稻粒黑粉病抗性育種研究提供了潛在的基因資源。

4 總結與展望

植物病原菌致病包括從識別、侵染到產孢等多個階段，每個階段寄主與病原菌之間的互作涉及多個生物學途徑及基因調控，是一個復雜的生物學過程。明確病原菌致病機理對防控植物病害具有重要意義。水稻稻粒黑粉病菌和稻曲病菌均為活體營養型真菌，且均侵染水稻花器官［6，39］?；ńz被稻曲病菌侵染后伸長受到抑制，不能形成成熟的花粉，受精過程遇阻，淀粉不能完成積累［40］。因此，稻曲病菌在侵染水稻過程中可能通過模擬水稻胚珠受精過程，誘導灌漿相關基因（OsRISBZ1）、種子儲藏蛋白基因（OsGlutln1、OsPromln2、Os03g58480）和淀粉代謝基因（OsSSIIIa、OsAGPS2b、Os02g32660）的表達，進而激活水稻灌漿信號途徑，為病原菌生長提供營養物質［41-43］。相關研究也表明，完成受精的子房可以阻礙稻曲病菌菌絲形成稻曲球［40-41］。而與之相反，稻粒黑粉病菌只有在受精完成的不育系中才能形成黑色粉狀的冬孢子［23］，我們推測稻粒黑粉病菌致病機制與稻曲病菌模擬水稻胚珠受精過程不同，應該存在其獨有的寄主-病原菌互作生物學過程。

致病功能基因研究可為稻粒黑粉病防治提供新的靶標，對促進該病的防控，提高雜交稻制種產量具有重大意義。隨著稻粒黑粉病菌基因組測序組裝的完成及侵染轉錄組數據的解析，為深入闡明其致病機制奠定了重要基礎。基于比較基因組學分析，挖掘與其它病原真菌致病相關基因同源性基因，是研究稻粒黑粉病菌致病基因的有效方法。MAPK（mitogen-activated protein kinases）信號途徑在植物病原真菌致病過程中具有重要的作用［44］。玉米黑粉病菌基因Ubc3是MAPK信號途徑的1個關鍵基因，與病原菌菌絲的生長相關，還可通過調節致病性發育基因 Prf1影響病原菌致病性［45］。稻粒黑粉病菌smut_0057基因是Ubc3的同源基因［23］，可能在稻粒黑粉病菌致病過程中發揮關鍵作用。HOG1信號途徑是植物病原真菌中較為保守的MAPK 途徑之一，其中的Hog1同源基因在真菌中具有較高的保守性，在維持病原菌細胞內外滲透壓平衡，氧化脅迫應答、致病過程中起重要作用［46］。Hog1的同源基因Smut_0038可能是稻粒黑粉病菌致病關鍵基因［23］。進一步的工作可通過構建稻粒黑粉病菌突變株系闡明這些基因在水稻-稻粒黑粉病菌互作過程中的作用。

此外，基于基因組功能基因注釋預測到的1 697個病原-寄主互作基因（pathogen-host interaction gene，PHI）中，部分基因是稻粒黑粉病菌特有的。這些基因可能參與了稻粒黑粉病菌的致病過程。進一步結合侵染轉錄組分析，預測了稻粒黑粉病菌潛在的效應蛋白，也為研究稻粒黑粉病菌新的致病功能基因提供了重要的依據。利用病原菌的致病基因挖掘寄主潛在的抗病基因是目前植物病理學領域的熱點研究內容。未來工作一方面可進一步完善稻粒黑粉病菌基因編輯體系，應用基因編輯技術驗證病原菌關鍵致病因子。另一方面，可充分利用已報道的致病相關基因，如smut_2965和smut_5844，挖掘寄主中與其相互識別的抗性靶基因。

盡管抗稻粒黑粉病水稻不育系資源的田間篩選方面有了一些進展，但其抗病相關位點及基因尚未見報道。生產上，應用抗病基因選育抗病品種是防控水稻病害最為有效的措施，然而抗稻粒黑粉病的遺傳機制尚不清楚，阻礙了其抗性品種的選育。在進一步的工作中，可利用現有抗病材料構建遺傳分離群體，通過高通量測序技術手段定位稻粒黑粉病抗病位點，進而克隆抗病基因?？共』蜓芯孔罱K意義是培育抗病品種。雖然基因組技術的不斷發展為抗病基因的挖掘提供了技術支撐，但如何將抗病基因應用到實際生產中才是科研工作最為關鍵的。制種產量較高的水稻不育系通常具有高異交性，柱頭外露率較大，大大提高了稻粒黑粉病的感病性［7，12］。結合分子生物學手段和常規雜交育種技術，已報道的稻粒黑粉病抗性水稻不育系4766A、江城3A和巨豐2A培育高異交抗病不育系［32］，進一步提高雜交稻制種產量是我們未來工作的核心目標。