一種基于PXR啟動子報告基因藥物篩選方法的構建及其應用

沈雅麗 潘陽陽 王靖雷 馬睿 趙改紅 王桂榮 張倩 王萌

（甘肅農業大學動物醫學院，蘭州 730070）

在藥物開發早期階段，篩選藥物用于靶標驗證和ADMET（吸收absorption，分布distribution，代謝metabolism，消除elimination和毒性toxicity）分析非常重要［1-2］，目前已有篩選方法評估小分子藥物藥理特性和調控機制，如動物體內試驗、高通量LCMS-MS方法等［3］，但由于成本高、試驗周期長，這些方法僅提供有限用途。因此尋求一種快速、高效的藥物篩選方法已成為近年來的研究焦點之一。孕烷X受體（pregnane X receptor，PXR）是核受體家族的重要成員之一，由NR1I2基因編碼，是機體解毒的重要核轉錄因子。PXR在藥物代謝方面和藥物相互作用方面具有重要作用，臨床上約50%藥物通過激活PXR介導的CYP3A4酶進行代謝［4］，并且還發現其參與更多的生理、病理過程，如維持機體細胞增殖分化、生長發育、新陳代謝、穩態維持和多種代謝性疾病、炎癥、癌癥等［5-6］。目前國內外已報道有關PXR和（或）其配體如何誘導或調節重要生理過程的研究［7-8］。PXR活化后影響藥物代謝酶和藥物轉運蛋白的表達與代謝，如細胞色素酶P450（cytochrome P450，CYP450）、谷胱甘肽轉移酶（glutathione-S-transferases，GSTs）、葡糖醛酸基轉移酶（UDP-glucuronyl transferases，UGTs）、多藥耐藥蛋白（multidrug resistance proteins，MDRs）、有機陰離子轉運多肽酶（organic anion transport peptidases，OATPs）等［9-10］。因此，尋找PXR的新誘導劑，不僅可以對研究CYPs的誘導及相應藥物-藥物相互作用和藥物研發提供指導，對于疾病的治療也具有極大意義。報告基因技術在基于細胞檢測方法的開發中發揮了重要作用［11］。本實驗旨在建立pGL3-basic-PXRpro報告基因藥物篩選方法，并考察恩諾沙星、氟苯尼考以及10種連翹天然產物激活mPXR的誘導效應。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物、細胞株與質粒 昆明小白鼠（20± 5 g）購自中國科學院蘭州獸醫研究所實驗動物中心（SCXK（甘）2015-0001）。動物購進適應性飼養3 d開始實驗，小鼠飼養條件：溫度（24±2）℃、濕度50%±5%、12 h明暗循環全價配合飼料以及純凈水供小鼠自由攝取。動物實驗程序與福利均符合實驗動物倫理學要求（倫理批準編號：GSAUAEW20200911）。Hepa 1-6小鼠肝癌細胞購自賽百慷生物技術股份有限公司；質粒pGL3-basic、pRL-TK購自Promega公司。

1.1.2 主要試劑及藥品 RNA提取試劑盒購自美國Omega公司；ClonExpress?II One Step Cloning Kit非連接酶依賴型單片段快速克隆試劑盒、HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）反轉錄試劑盒、DL 2 000 Plus DNA Marker和DL 15 000 DNA Marker購自南京諾唯贊生物科技有限公司；GoTaq Green Master Mix 2×、Dual-Luciferase?Reporter Assay System購自Promega公司；限制性內切酶Xho I、Hind Ⅲ均購自TaKaRa公司；通用型DNA純化回收試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒、質粒大提試劑盒、感受態大腸桿菌Escherichia coli DH5α均購自天根生化科技有限公司；脂質體Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；DMEM/F-12培養基和胎牛血清購自Gibco公司；地塞米松、恩諾沙星、氟苯尼考、金絲桃苷、熊果酸、秦皮乙素、柚皮素、甘草次酸和莽草酸購自上海源葉生物科技有限公司；連翹酯苷A、連翹苷、連翹脂素和牛蒡子苷購自南京源植科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組RNA提取 取小鼠新鮮肝組織，按Omega RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，用HiScriptII 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）反轉錄試劑盒說明書將其反轉錄為cDNA，用作PCR模板，-20℃保存，備用。

1.2.2 目的片段引物設計和合成 根據同源重組引物設計原則和小鼠PXR基因啟動子序列（選取轉錄起始位點上游2 kb），采用同源重組法設計引物，引物序列見表1。上游引物加入Xho I酶切位點（CTCGAG），下游引物加入Hind Ⅲ酶切位點（AAGCTT）；引物由上海生工生物工程有限公司合成，PXR啟動子擴增片段長度為2 042 bp。構建流程圖如圖1所示。

圖1 pGL3-basic-PXRpro重組質粒構建流程Fig.1 Construction process of pGL3-basic-PXRpro recombinant plasmid

表1 引物序列表Table 1 List of primer sequence used in PCR

1.2.3 目的片段擴增 以1.2.1中反轉錄的cDNA作為PCR模板，擴增PXR啟動子DNA序列。擴增體系為：GoTaq Green Master Mix 2× 10 μL、模板DNA 1 μL、上下游引物各0.5 μL、RNase-free ddH2O 8 μL。反應參數設置：95℃預變性2 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸125 s，擴增35個循環；72℃最后延伸5 min。取5 μL PCR產物于1%瓊脂糖凝膠中，在180 V電壓下電泳30 min，254 nm紫外燈下觀察結果。

1.2.4 pGL3-basic-PXRpro構建及鑒定 從瓊脂糖凝膠中切出需回收的目的條帶，電泳條帶用通用型DNA純化回收試劑盒對PCR反應產物進行純化。純化后再次進行瓊脂糖凝膠電泳確認。將PCR純化產物與pGL3-basic分別進行雙酶切。將雙酶切后的DNA片段和線性化pGL3-basic載體用ClonExpress?II One Step Cloning Kit試劑盒進行連接，重組反應體系（20 μL）見表2。體系置于PCR儀中37℃，反應30 min降至4℃，或立即置于冰上冷卻。連接的PCR產物轉化感受態細胞DH5α，接種于含氨芐抗性的LB培養皿培養12-16 h，挑取重組反應轉化板上陽性克隆菌落，用F和R引物進行菌落PCR以鑒定目的片段是否轉入。將經過鑒定的陽性克隆菌落提取質粒，送上海生工生物工程有限公司進行測序。構建成功后重組載體命名為pGL3-basic-PXRpro。

表2 重組反應體系Table 2 Recombination reaction system

1.2.5 細胞培養與轉染 Hepa 1-6小鼠肝癌細胞培養在Dulbecco改良Eagle培養基（DMEM/F-12），另加10%胎牛血清、1%青/鏈霉素、1%丙酮酸鈉，培養條件為37℃、5%二氧化碳。設空白組（只鋪細胞不做轉染）、空載組（0.2 μg pGL3-basic + 0.01 μg pRL-TK）、攜帶報告基因載體的對照組（0.2 μg pGL3-basic-PXRpro + 0.01 μg pRL-TK）、小鼠PXR的陽性誘導劑地塞米松組（地塞米松 + 0.2 μg pGL3-basic-PXRpro + 0.01 μg pRL-TK）。轉染前，將Hepa 1-6細胞以2×104/孔接種于96孔板培養，待生長融合度達70%-80%；在轉染前1 h，換無血清DMEM培養基，PXR的陽性誘導劑地塞米松組加入含地塞米松（10 μmol/L）的培養基；轉染時，將質粒瞬時轉染至相應孔內細胞，實驗按Lipofectamine 2000轉染試劑盒提供的方案操作。每組設3個復孔，獨立重復實驗3次。

1.2.6 雙熒光素酶活性檢測細胞 經轉染處理24 h后，用預冷的PBS溶液潤洗3次，盡量吸凈孔內的液體，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒的操作說明，用GLOMAX 20/20發光檢測儀進行雙熒光素酶活性測定。主要操作步驟：用ddH2O將5×Passive lysis buffer 5倍比稀釋，以每孔20 μL體積加入到96孔板中，于水平搖床室溫輕緩晃動15 min，至細胞裂解完全。取上述各孔細胞裂解液10 μL于1.5 mL EP管中，加50 μL LAR II，快速測定螢火蟲熒光素酶活性。再加50 μL Stop＆GLO試劑，測定海腎熒光素酶活性。記錄螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值。

1.2.7 恩諾沙星、氟苯尼考以及10種連翹天然產物對PXR啟動子的誘導作用 應用pGL3-basic-PXRpro報告基因法檢測恩諾沙星、氟苯尼考及連翹中10種天然產物對mPXR的激活作用。采用等差法進行藥物稀釋，藥物濃度為0、20、40、60、80、100 μmol/L。以10 μmol/L的地塞米松作為陽性對照，將0.2 μg pGL3-basic-PXRpro + 0.01 μg pRL-TK共 轉染每孔細胞。按照1.2.5中的步驟處理細胞，24 h后根據1.2.6的方法測定雙熒光素酶活性。每組設3個復孔，獨立重復實驗3次。

1.2.8 統計學處理 使用GraphPad Prism軟件對各組熒光素酶活性的試驗結果進行統計學分析，采用SPSS軟件對試驗結果進行組間單因素方差分析和t檢驗，以P＜0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 小鼠PXR啟動子區域擴增

以1.2.1中反轉錄的cDNA作為模板擴增PXR啟動子區域序列，得到長度為2 042 bp的片段，PCR產物凝膠電泳鑒定結果見圖2，PXR啟動子擴增片段大約為2 000 bp。

圖2 PCR擴增PXR啟動子片段凝膠電泳Fig.2 Gel electrophoresis of PCR amplified PXR promoterfragment

2.2 重組質粒的篩選及菌落PCR

將PXR啟動子片段條帶進行純化回收，將PXR啟動子片段和pGL3-basic載體雙酶切（Xho I和Hind Ⅲ）后進行重組反應，重組產物轉化感受態細胞DH5α，涂布含氨芐抗性的LB培養皿，過夜培養，重組反應轉化板上形成數百個單克隆菌落，陰性對照反應轉化板上的克隆菌落數顯著少于前者，結果如圖3所示。在重組反應轉化板上挑取陽性克隆菌落進行菌落PCR，結果如圖4所示，第2泳道中擴增條帶大小約為2 000 bp。說明重組質粒中含有PXR啟動子片段。

圖3 重組產物轉化Fig.3 Recombinant product transformation

圖4 菌落PCR凝膠電泳Fig.4 Colony PCR gel electrophoresis

2.3 重組質粒的雙酶切及測序鑒定

將初步篩選的陽性單克隆菌落進行搖菌、小提質粒后進行雙酶切，結果如圖5所示，重組質粒在相應片段大小的位置切出載體片段和目的DNA片段，釋放2 042 bp大小的片段。測序結果（圖6）可知，由于測序時雜質干擾的原因，兩端大約50 bp干擾較大，有1-2 bp突變，其余與原序列完全一致，證實重組質粒包含PXR啟動子序列且插入方向正確。以上結果表明包含PXR啟動子序列的報告基因載體pGL3-basic-PXRpro構建成功。

圖5 pGL3-basic-PXRpro雙酶切鑒定電泳Fig.5 Gel electrophoresis of pGL3-basic-PXRpro by double restriction enzymes digestion

圖6 pGL3-basic-PXRpro的部分測序結果Fig.6 Partial sequencing results of pGL3-basic-PXRpro

2.4 地塞米松對pGL3-basic-PXRpro報告基因轉錄活性的驗證

用mPXR的經典誘導劑地塞米松（10 μmol/L）來驗證pGL3-basic-PXRpro作為藥物篩選工具的可行性和有效性。由圖7可以看出，攜帶報告基因載體的對照組（圖7-C）相對熒光素酶活性顯著高于空載組（圖7-B）（P＜0.05），小鼠PXR陽性誘導劑地塞米松組（圖7-D）相對熒光素酶活性顯著高于攜帶報告基因載體的對照組（P＜0.05）。由表3可以看出，經過3次獨立重復實驗結果顯示每個樣品的相對熒光素酶活性表達穩定，小鼠PXR陽性誘導劑地塞米松組的相對熒光素酶活性之間無顯著差異（P＞0.05）。以上結果證明，pGL3-basic-PXRpro作為藥物篩選工具的可行性和有效性。

表3 地塞米松3次獨立重復實驗的相對熒光素酶活性Table 3 Relative luciferase activity of dexamethasone in three independent repeated experiments

圖7 PXR啟動子報告基因藥物篩選方法構建的驗證Fig.7 Validation of constructed PXR promoter reporter gene drug screening method

2.5 兩種抗菌藥對pGL3-basic-PXRpro報告基因轉錄活性的影響

應用已成功構建的報告基因藥物篩選方法檢測恩諾沙星、氟苯尼考對mPXR啟動子的激活作用。0.2 μg pGL3-basic-PXRpro和0.01 μg pRL-TK 共 轉 染 的Hepa 1-6細胞經地塞米松（10 μmol/L）及恩諾沙星、氟苯尼考孵育24 h后，根據1.2.6方法檢測相對熒光素酶活性。如圖8所示，恩諾沙星、氟苯尼考在20-100 μmol/L對PXR啟動子均有激活作用。

圖8 兩種抗菌藥作用Hepa 1-6細胞后的相對熒光素酶活性Fig.8 Relative luciferase activity of two antibacterial drugs after treated in Hepa 1-6 cells

2.6 基于小鼠pGL3-basic-PXRpro報告基因法對10種連翹天然產物的篩選

應用已成功構建的報告基因藥物篩選方法檢測10種連翹天然產物對mPXR啟動子的激活作用。0.2 μg pGL3-basic-PXRpro和0.01 μg pRL-TK 共 轉 染 的Hepa 1-6細胞經地塞米松（10 μmol/L）及10種天然產物孵育24 h后，根據1.2.6方法檢測相對熒光素酶活性。如圖9所示，金絲桃苷在20-100 μmol/L對PXR啟動子均有激活作用，20-60 μmol/L對PXR啟動子是激活作用，但在80-100 μmol/L激活作用逐漸降低；熊果酸在20-100 μmol/L均可激活PXR啟動子；秦皮乙素對PXR啟動子的激活作用最弱，在20-100 μmol/L對PXR啟動子的激活作用變化不大；柚皮素在20-60 μmol/L對PXR啟動子具有激活作用且呈劑量依賴性，但在80-100 μmol/L無PXR啟動子活性；甘草次酸在20-60 μmol/L濃度下可以激活PXR啟動子無劑量依賴，在80-100 μmol/L則對PXR 啟動子無激活作用；莽草酸在20-40 μmol/L對PXR啟動子無激活作用，但在60-100 μmol/L對PXR啟動子有激活作用；連翹酯苷A在20-100 μmol/L對PXR啟動子激活作用最為明顯；連翹苷在20-100 μmol/L對PXR啟動子均有激活作用，但在100 μmol/L時相對活性降低，20-80 μmol/L呈劑量依賴；連翹脂素在20-100 μmol/L對PXR啟動子均為誘導作用并呈劑量依賴；牛蒡子苷對PXR啟動子激活作用較高，在20-60 μmol/L呈劑量依賴，80 μmol/L激活作用下降，在100 μmol/L對PXR啟動子無激活作用。9種天然產物對PXR啟動子轉錄活性有一定的誘導作用，具有顯著統計學差異（P＜0.05）。

圖9 10種連翹天然產物作用Hepa 1-6細胞后的相對熒光素酶活性Fig.9 Relative luciferase activity of 10 kinds of Forsythia suspensa natural products treated on Hepa 1-6 cells

3 討論

我國中草藥資源豐富，目前已有較多報道表明中藥提取物和天然產物可激活PXR起到治療疾病的作用［12-13］。闡明PXR在生理或病理過程中的作用既是在藥理學的重大挑戰，又是確定新的藥物發現靶標的潛在機會［14］。因此構建一種基于mPXR啟動子雙熒光素酶報告基因的藥物篩選方法具有重要意義。如何快速、高效的篩選PXR誘導劑，不僅有助于研究PXR誘導的CYPs藥物-藥物相互作用，還可以為藥物研發和臨床用藥安全提供一定的理論指導。

地塞米松是小鼠PXR公認的經典誘導劑［15］，通過地塞米松來驗證pGL3-basic-PXRpro報告基因藥物篩選方法/模型的可行性和有效性。本試驗結果顯示，攜帶報告基因載體的對照組較空載組差異顯著，表明構建的小鼠pGL3-basic-PXRpro報告基因具有啟動子活性，其相對活性為0.112 9；小鼠PXR陽性誘導劑地塞米松組較攜帶報告基因載體的對照組差異顯著，說明地塞米松能顯著誘導PXR的轉錄活性。以上結果證明基于小鼠pGL3-basic-PXRpro報告基因的藥物篩選方法構建成功，作為藥物篩選工具是可行的。由表3可以看出，經過3次獨立重復實驗結果顯示每個樣品的相對熒光素酶活性表達穩定，小鼠PXR陽性誘導劑地塞米松組的相對熒光素酶活性之間無顯著差異。進一步證實了pGL3-basic-PXRpro作為藥物篩選工具的有效性。總之，pGL3-basic-PXRpro報告基因藥物篩選方法可用于篩選誘導PXR的藥物單體及天然產物。

抗菌藥物可刺激肝臟解毒的I相酶［16］，也可誘發藥物性肝損傷［17］，PXR是肝臟藥物清除系統的主要調節因子，在藥物性肝損傷起關鍵作用［18］。恩諾沙星和氟苯尼考是新一代常見的動物專用抗菌藥，均能通過影響肝臟CYP450酶對肝臟造成損傷［19-21］。將構建成功的報告基因藥物篩選方法用于考察恩諾沙星和氟苯尼考對PXR啟動子的誘導效應。劉婉玉等［22］通過代謝抑制實驗得出，恩諾沙星在鯽魚肝微粒體代謝過程中的關鍵酶是CYP3A4。本試驗結果表明，20-100 μmol/L恩諾沙星能顯著誘導PXR的表達。由此推斷恩諾沙星可能是通過PXR介導的CYP3A4酶進行代謝。有研究表明，氟苯尼考對家兔肝臟CYP3A的基因表達具有誘導作用，但家兔肝臟中CYP3A的誘導是否由PXR介導有待進一步研究［23］。本試驗結果表明，20-100 μmol/L氟苯尼考能顯著誘導PXR的表達，但氟苯尼考是否通過誘導PXR介導的CYP3A酶進行代謝，有待進一步研究。由于種屬之間存在差異，恩諾沙星、氟苯尼考對PXR靶基因的作用還需進一步研究。

近幾年連翹用量逐年增長，作為常用大宗藥材之一，連翹具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗癌、保肝等藥理作用，具有很好的開發前景和藥用價值［24］。本試驗采用報告基因藥物篩選法對連翹的10種天然產物進行了篩選。有研究表明配體激活的PXR通過抑制核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和激活蛋白1（activator protein-1，AP-1）在肝臟中的表達而發揮抗炎作用［25-26］。本試驗結果表明100 μmol/L連翹脂苷A、20-80 μmol/L金絲桃苷和20-60 μmol/L牛蒡子苷均能顯著誘導PXR的表達，與陳麗青［27］、Pan等［28］、Kim等［29］、Lee等［30］的研究結果一致，表明通過pGL3-basic-PXRpro報告基因藥物篩選方法篩選的3種天然產物對PXR具有誘導作用，提示3種天然產物可能具有作為PXR介導抗炎候選藥物的潛力，對臨床用藥具有參考價值。PXR的激活使肝臟中藥物代謝速率加快并誘導多藥耐藥蛋白（MDR）表達，大多數藥物抗性酶的產生由PXR靶基因編碼，因此在癌癥化療過程中更易發生多藥耐藥［31］。有研究發現連翹提取物具有逆轉多藥耐藥作用［32-34］，本試驗結果表明熊果酸、柚皮素、莽草酸、牛蒡子苷等均對PXR有誘導作用，進一步研究連翹提取物與PXR之間的關聯，可為治療癌癥藥物的研究開發提供新方向。另外，有研究報道，熊果酸能夠通過激活PXR的表達抵抗四氯化碳導致的急性肝損傷和肝臟纖維化損傷［35-36］。本試驗結果表明，20-100 μmol/L熊果酸能顯著誘導PXR的表達，提示熊果酸可能具有作為PXR介導抗急性肝損傷、抗肝臟纖維化損傷候選藥物的潛力。樊威洋等發現，100 μmol/L柚皮素能顯著下調HepaRG細胞PXR的蛋白表達，柚皮素可以發揮抗肝癌和肝損傷的作用［37-38］，為肝病治療提供理論依據。本試驗結果顯示，20-60 μmol/L柚皮素對PXR起激活作用，80-100 μmol/L起抑制作用，提示柚皮素發揮抗癌和抗肝損傷作用的最佳用量可能在80-100 μmol/L之間。He等［39］研究發現，柴胡疏肝散中的生物活性成分甘草次酸有提高細胞核受體PXR蛋白表達量的趨勢，但沒有顯著差異，甘草次酸可激活PXR來增強CYP3A4的表達，從而起到治療抑郁癥的作用。本試驗結果表明，20-60 μmol/L甘草次酸能顯著誘導PXR的表達，說明了甘草次酸可激活PXR，但沒有顯著差異，He等同樣佐證了本試驗中甘草次酸對PXR的誘導作用。Rasmussen等［40］在研究菊苣次生代謝物對原代豬肝細胞CYP mRNA表達的調節時發現，菊苣次生代謝物秦皮乙素對CYP3A沒有誘導作用，而對CYP1A2具有誘導作用，秦皮乙素可能是激活了AhR。由于種屬之間存在差異，秦皮乙素對CYPs的作用有待進一步研究。本試驗結果表明，不同濃度秦皮乙素對PXR啟動子的激活作用變化無顯著差異，提示秦皮乙素可能不是PXR配體。

綜上所述，采用本試驗構建的pGL3-basic-PXRpro報告基因藥物篩選方法可以快速、便捷地篩選出PXR的誘導劑。本試驗研究結果說明了恩諾沙星、氟苯尼考以及10種連翹天然藥物對PXR轉錄水平的干預，報告基因藥物篩選方法為有效篩選PXR介導的肝損傷和藥物研發提供工具，同時為PXR為靶點的疾病防治提供候選藥物。報告基因藥物篩選方法作為體外PXR誘導劑的初篩手段，體內的作用機制還需進一步探究。

4 結論

本研究成功構建了小鼠pGL3-basic-PXRpro報告基因載體，建立了pGL3-basic-PXRpro報告基因的藥物篩選方法，并成功篩選出了PXR的誘導劑。報告基因藥物篩選法具有快速高效且操作周期短的特點，為進一步研究PXR介導的肝損傷機制和藥物研發奠定了基礎。