水稻熱激轉錄因子研究進展

劉曉藝 羊健 劉敬 王冰 戴良英 李魏

（1. 湖南農業大學植物保護學院，長沙 410128；2. 寧波大學植物病毒學研究所，寧波 315211）

植物在生長發育過程中會受到很多逆境脅迫的影響，比如生物脅迫（害蟲、病原微生物等）和非生物脅迫（極端溫度、高鹽和干旱等）。在優勝劣汰的自然選擇下，植物自身形成了一系列復雜有序的機制來感知和抵御環境帶來的不利影響。在植物體內具有可以調控抵御高溫脅迫信號的重要元件，即熱激轉錄因子（heat shock transcription factors，HSFs）［1-2］。HSFs對熱激蛋白（heat shock proteins，HSPs）的轉錄激活被認為在植物熱應激的反應中起關鍵作用［3］。位于脅迫響應信號末端的HSFs能夠特異性結合高度保守的熱激元件（heat shock element，HSE），從而與其他轉錄因子聚集共同形成轉錄復合體以調控HSPs的表達進而調控植物對高溫脅迫的抗性［4］。此外，已有研究表明，HSFs還參與調控植物對其他非生物脅迫和生物脅迫的抗性。本文主要對水稻熱激轉錄因子的結構與分類、功能和作用分子機制研究進展進行了綜述。

1 HSFs的典型結構

研究發現，植物HSFs雖在序列大小上存在明顯差異，但都具有相似的結構模式，包括保守的DNA結合結構域（DNA binding domain，DBD）、寡聚化結構域（oligomerization domain，OD）、核定位信 號（nuclear localization signal，NLS）結 構、核輸出信號（nuclear export signal，NES）結構以及C端激活結構域（C-transcriptional activation domain，CTAD）5個部分［5］。

1.1 DNA結合結構域（DBD）

高度結構化的DBD結構域是HSFs中最保守的區域，靠近HSFs的N端，約由100個氨基酸組成，含有3個α-螺旋和4個β-折疊形成一個疏水核心［6］。并且DBD的螺旋-轉角-螺旋（H2-T-H3）結構具有分解代謝激活蛋白的的特征［7］，能夠精準定位并特異性識別同樣高度保守的HSE的保守基序，從而進一步激活靶標基因的轉錄及表達［8］。

1.2 寡聚化結構域（OD）

HSFs都含有1個OD結構，OD的氨基酸序列含有2個疏水七肽重復區域A和B（HR-A/B）。每個重復區域形成1個以亮氨酸拉鏈為特征的卷曲螺旋結構，植物遭受熱激脅迫時，HSFs通過該卷曲螺旋結構形成同源三聚體，促使HSFs與其靶標的HSE結構結合調控熱激脅迫響應［9］。其中，OD結構是判定HSFs家族成員分類的重要依據［10］。根據序列的相似性和OD的結構特性，可以將植物HSFs劃分為進化保守的A、B、C三大類。植物B類HSFs的HR-A/B結構區域緊湊，在HR-A與HR-B之間沒有氨基酸殘基插入，而植物A類HSFs和C類HSFs的HR-A和HR-B區域間分別插入了21個和7個氨基酸而得到了擴展［11］。

1.3 核定位信號（NLS）和核輸出信號（NES）結構域

NLS結構與OD結構的C端相鄰，由一簇富集賴氨酸和精氨酸的堿性氨基酸殘基組成，與HSFs亞細胞定位和進入細胞核有關。有些HSFs的C末端還具有富含亮氨酸的NES結構，與植物細胞內的蛋白向核外輸出密切相關。NLS與NES協同作用可以控制HSFs在細胞核及細胞質中的自由分布［12］。

1.4 C端激活結構域（CTAD）

CTAD是HSFs序列上最不保守的區域，含有由芳香族氨基酸殘基（色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸）、大的疏水性氨基酸殘基（亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸）和酸性氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸）組成的短 肽AHA（aromatics，hydrophobic and acidic amino acid residues）基序［11］。AHA基序與一些基本轉錄復合物結合，是HSFs進行轉錄激活時所必需的條件，而只有A類HSFs具有AHA基序。因此，通常認為只有A類HSFs具有轉錄激活功能，B、C兩類HSFs則不具有轉錄激活功能［13］。

1.5 水稻體內HSFs的分類

水稻HSFs的組成和功能具有多樣性（表1），這或許是水稻適應自然環境導致的進化結果。

表1 水稻HSFs的分類與生物學功能Table 1 Classification and biological functions of rice HSFs

2 OsHSFs在水稻抗非生物脅迫信號轉導中的功能與機制

水稻在其生命周期中會遇到很多的非生物脅迫，常見的包括極端溫度脅迫、干旱脅迫、高鹽脅迫、氧化脅迫、重金屬脅迫等。大量研究表明，水稻HSFs在調控植物抗非生物脅迫的功能中發揮至關重要的調控作用。

2.1 HSFs在水稻抗溫度脅迫中的功能與應用

高溫脅迫是水稻生長發育過程中常見的環境脅迫因子，會導致水稻的減產甚至顆粒無收。高溫脅迫一般通過破壞水稻體內細胞膜結構、影響酶的活性以及蛋白質結構來影響細胞的功能，從而導致水稻體內的代謝紊亂甚至是大量累積有害物質，情況嚴重時甚至會導致水稻死亡［11］。為減少高溫脅迫帶來的危害，水稻需要一系列功能基因和蛋白的參與來適應環境，其中就包括HSFs［32］。楊雙蕾［17］通過對水稻OsHsfA2e過表達轉基因株系和野生型株系進行熱處理，測量它們的莖葉生理指標發現，過表達株系體內的H2O2含量，SOD活性以及POD活性的升高速度比野生型快；而葉綠素的降低速度比野生型的要慢，并且始終維持在一個較高的水平。并且根據熱處理之后的表型分析發現，野生型株系的萎蔫情況特別嚴重，而過表達株系莖葉的生長情況比野生型株系要健壯且基本不發生萎蔫，說明OsHsfA2e能夠提高水稻的耐熱性。此外，研究發現OsHsfA2d能夠編碼2種剪接變體蛋白OsHsfA2dI和OsHsfA2dII，在正常條件下，OsHsfA2dII是顯性但轉錄無活性的剪接形式；當植物遭受高溫脅迫時，OsHsfA2d剪接成轉錄活性形式OsHsfA2dI，進而參與熱應激反應以提高水稻植株的耐熱性［16］。

Mittal等［24］與Chauhan等［18］對水稻植株進行4℃低溫脅迫處理后發現，A類HSFs基因OsHsfA3、OsHsfA4d、OsHsfA7和OsHsfA9，B類HSFs基 因Os-HsfB4b以及C類HSFs基因的表達量都顯著上調。其中OsHsfC1b受低溫誘導超強表達，作為主要的低溫感受元件存在。這些結果說明HSFs在水稻抵御低溫脅迫的信號中也發揮著重要作用。此外，冉靜［27］發現，對水稻OsHsfB2b過表達和RNAi轉基因植株幼苗進行5℃低溫脅迫處理2周后，OsHsfB2b-RNAi及非轉基因對照全部死亡，而OsHsfB2b過表達植株仍有13%的存活率，表明OsHsfB2b基因的過表達可以提高水稻對低溫脅迫的耐受性。

2.2 OsHSFs在水稻抗干旱脅迫信號轉導中的功能與機制

在自然條件下，干旱脅迫往往與高溫脅迫同時發生。干旱脅迫對植物造成的生理影響表現在氣孔關閉，光合作用和呼吸作用減弱等方面，在分子生物學水平上則表現為HSPs的積累。并且植物在應對干旱脅迫時會產生一種重要的化合物，即肌醇半乳糖苷合成酶（GolS1）。研究發現，植物HSFs可能通過介導目的基因GolS1的表達來參與植物干旱脅迫應答機制，此外還能作用于下游干旱相應元件結合因子DREB2A和DREB2C，提高部分干旱脅迫響應基因的表達［33］。

有研究發現，通過觀測OsHsfA7過表達植株和野生型植株斷水處理10 d后復水10 d的表型，野生型植株進一步枯萎而OsHsfA7過表達植株中的一部分恢復了正常的生長［22］。OsHsfB2b是水稻B類HSFs的成員，可模擬干旱信號的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）處理對OsHsfB2b表達有強烈的誘導作用，OsHsfB2b過表達植株的耐旱性顯著降低，而OsHsfB2b-RNAi轉基因植株的耐旱性增強。在干旱脅迫下，轉基因水稻OsHsfB2b的相對電導率（relative electrical conductivity，REC）和丙二醇（malondialdehyde，MDA）含量增加，脯氨酸含量下降，而OsHsfB2b-RNAi轉基因植株的REC和MDA含量降低，脯氨酸含量增加［23］。過表達OsHsfB2b能夠降低水稻種子萌發期的耐旱性，且OsHsfB2b過表達會降低水稻對干旱脅迫的耐受性，表明OsHsfB2b負調控水稻的耐旱性［27］。由此可見，OsHSFs通過不同的作用機制參與水稻對干旱脅迫的調控。

2.3 OsHSFs在水稻抗其他非生物脅迫中的功能與機制

鹽堿化的土地會嚴重影響農作物的產量，已有研究表明轉錄因子能夠增強作物的耐鹽性［34］。據報道，HSFs同樣可以介導水稻的耐鹽性。水稻體內 的OsHsfA2a、OsHsfA2b、OsHsfA2c、OsHsfA2d、OsHsfA2e、OsHsfA4b、OsHsfA5、OsHsfA7、OsHsfA9、OsHsfC1b等基因在高鹽脅迫下都能被誘導表達，從而能提高植物的抗高鹽脅迫能力［15，31］。此外，上文提及的OsHsfB2b-OX轉基因水稻種子在高鹽處理下的苗高和萌發率均低于對照［27］；并且OsHsfB2b過表達轉基因水稻的耐鹽性顯著降低，而OsHsfB2b-RNAi轉基因水稻的耐鹽性增強［23］，表明OsHsfB2b蛋白負調控水稻的耐鹽性。

氧化脅迫是高溫、高鹽等逆境引起的二級脅迫，引起水稻體內ROS的大量積累，對細胞中的蛋白質、脂質和核酸造成損傷，導致細胞的代謝功能降低甚至細胞死亡［15］。已有報道表明，氧化脅迫會引起水稻體內多個OsHSFs轉錄表達增強［35］。Mittal等［14］發現OsHsfA2a、OsHsfB4b和OsHsfC2a是ROS積累和感知途徑中的主要參與者，并且提出在所有OsHSFs中，OsHsfA2a在氧化應激的兩個時間點（即1 h和4 h）表達最高，而OsHsfA2f和OsHsfA7可能參與氧化應激的后期反應。此外，用ABA和H2O2處理水稻后，OsHsfA4a和OsHsfA2基因的表達均上調，分別在4 h處理時間內產生2個表達高峰；又通過H2O2清除劑和抑制劑預處理試驗證明，ABA對水稻HSFs基因的誘導作用是通過ABA誘導產生的H2O2來實現的［19］。由于OsHsfA2在干旱和活性氧脅迫下表達量均升高，說明OsHSFA家族和水稻的抗氧化脅迫行為密切相關。

農業土壤的鎘污染已造成一些糧食作物和蔬菜等農產品質量的下降，影響了農業的可持續發展［36］，因此植物耐鎘性的分子調控具有重要意義。Shim等［20］對小麥基因進行篩選，發現熱激轉錄因子TaHsfA4a參與調控植物對鎘的耐受性。水稻體內與TaHsfA4a同源性最高的OsHsfA4a蛋白也同樣能夠在酵母系統中提高對鎘的耐受性，但同源性第二高的OsHsfA4d沒有此功能。相應地，異源表達TaHsfA4a的水稻植株對鎘的耐受性增強，而OsHsfA4a基因被敲除的水稻植株對鎘的耐受性降低。對利用TaHsfA4a和OsHsfA4d構建的嵌合蛋白進行功能結構域分析，結果表明HsfA4a的DBD對于鎘耐受性起關鍵作用，而在DBD內，Ala-31和Leu-42位點對于鎘耐受性是非常重要的［20］。此外，TaHsfA4a介導的鎘抗性需要金屬硫蛋白（metallothionein，MT），在小麥和水稻的根部，鎘脅迫引起HsfA4a和MT基因的轉錄水平提高。因此該研究結果表明，小麥和水稻的HsfA4a通過上調MT基因表達來提高植物的鎘耐受性。

3 OsHSFs在水稻抗病信號轉導中的功能與機制

3.1 OsHSFs在水稻抗稻瘟病中的功能與機制

稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病發病于水稻的各個生育期，是水稻生產上的毀滅性病害，在世界各水稻產區都有發生［37］。防治稻瘟病最經濟、有效的方法就是培育抗病水稻品種。N-乙酰殼寡糖（GNn）作為病原物相關分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP），在水稻中被模式識別受體CEBiP［38］和OsCERK1［39］感知。一旦與受體結合，GNn會激發一系列植物免疫反應，包括基因表達變化、MAPK級聯反應、ROS積累等［40］。水稻GRAS家族蛋白CIGR2是1個GNn信號應答基因，其活性通過OsHsf23直接轉錄控制，在病原物感染期間介導過敏性細胞死亡的激活。CIGR2以及OsHsf23的RNAi轉基因植株的葉鞘表皮細胞在接種稻瘟菌無毒菌株后表現出高度顆粒化，而這兩種轉基因植株的抗性并未發生改變，這表明CIGR2可能通過激活OsHsf23以抑制稻瘟病菌引起的不親和互作中水稻細胞過度死亡［30］。

3.2 OsHSFs在水稻抗白葉枯病中的功能與機制

由 黃 單 胞 菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）引起的白葉枯病是導致水稻減產的重要細菌性病害。白葉枯病是Xoo通過水孔或傷口進入水稻葉片，入侵維管組織而引起的［41］。水稻抗病品種‘SH5’和感病品種‘8411’接種Xoo 6 h后，OsHsfA2s、OsHsfB2s 和OsHsfC2b等11個HSFs成 員在抗、感品種‘SH5’和‘8411’中的表達水平存在顯著差異［42］。而有研究分析了7個OsHSFs基因（OsHsfA2a、OsHsfA2c、OsHsfA2d、OsHsfB2a、OsHsfB2b、OsHsfB2c1和OsHsfB2c2）在水稻葉片接種Xoo小種P6后的表達情況，發現僅OsHsfB2c2參與了水稻對白葉枯病的抗性［29］。由此可見，HSFs成員在水稻對白葉枯病的防御過程中發揮重要作用。此外，有報道表明OsHsfB4d通過與OsHsp18.0-CI的啟動子結合進而調控對白葉枯病的抗性［28］。

3.3 OsHSFs在水稻抗細菌性條斑病中的功能與機制

由另一黃單胞菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola，Xoc）引起的細菌性條斑病是影響全球水稻生產的重要病害之一［43］。Xoc通過傷口或氣孔入侵水稻，定殖于水稻葉片的薄壁組織細胞間并擴展形成條狀病斑，隨著病斑的不斷擴大，會導致水稻葉片的枯死。在水稻上接種Xoc菌株RS105后發現可以上調熱激轉錄因子OsHsp18.0-CI的表達［44］。過表達OsHsp18.0-CI的轉基因水稻明顯增強對Xoc菌株RS105的抗性，而OsHsp18.0-CI表達受抑制的水稻株系對RS105菌株的抗性則相應降低。進一步研究發現，通過RNA-seq，與野生型水稻相比，基礎防御相關基因的表達在OsHsp18.0-CI過表達水稻植株中明顯增強。接種RS105菌株后，這些抗病基因的表達在OsHsp18.0-CI過表達水稻植株中相較于野生型對照植株更強烈地激活［45］。由此發現OsHsp18.0-CI正調節水稻對細菌性條斑病的抗性。除此之外，用Xoc菌株RS105在中華11（野生型，ZH11）和過表達OsHsp18.0-CI的水稻中接種后OsHsfB4d均上調。并且過表達OsHsfB4d的水稻植株對RS105抗性增強，OsHsp18.0-CI和致病相關基因表達增加。此外OsHsfB4d直接與OsHsp18.0-CI啟動子中攜帶唯一HSE的DNA片段結合［28］，這表明OsHsfB4d參與了水稻對細菌性條斑病的防御過程。

3.4 OsHSFs在水稻葉片假病斑中的功能與機制

植物類突變體是指在沒有明顯機械損傷、病原物侵染或者逆境脅迫的情況下，植物組織在葉片、葉鞘等部位自發形成類似病原物侵染和壞死斑的一類突變體［46］。許多水稻斑點葉突變體是了解水稻抗稻瘟病、抗白葉枯病和細胞程序性死亡機制的理想來源［47］。水稻類病變突變發生的原因比較復雜，除了受內部基因的調控之外，光照、溫度和濕度等環境因素也會導致一些類病變突變體壞死斑的形成［21］。通過測序分析和互補實驗發現，斑點葉基因spl7編碼OsHsfA4d［48］。在高溫及光照條件下，突變體spl7從分蘗到抽穗，整個葉片表面均分布著相對較小的紅棕色小點［21，48］，而當降低溫度，或遮去光照中的紫外線，葉片斑點癥狀均會減輕。但是，無論是高溫或紫外線處理，突變體spl7在幼苗和嫩葉中沒有發現任何損傷［48］，這表明OsHsfA4d負調控光溫下水稻的細胞死亡，在抑制水稻葉片假斑病中起到作用。

4 OsHSFs在水稻體內的其他功能

除了參與水稻對各種脅迫的應答之外，OsHSFs還參與了調控水稻的生長發育過程。例如通過比較OsHsfA7過表達植株和野生型植株的根系不同，發現OsHsfA7過表達水稻的側根和根毛在苗期短于野生型對照植株，但是OsHsfA7過表達水稻的主根比野生型對照植株更長，說明OsHsfA7在水稻根的生長過程中起重要作用［22］。通過對OsHsf18轉基因水稻植株進行農藝性狀調查之后發現，OsHsf18過表達植株與野生型對照植株相比，植株變矮，分蘗數減少，結實率降低，千粒重下降［45］。OsHsf18-RNAi轉基因植株與野生型植株相比，雖然在株高和分蘗數上無明顯差異，但是結實率低，千粒重下降［25-26］。說明OsHSF18參與調控水稻的農藝性狀，其轉錄水平過高或過低對植株的生長發育都有一定的影響。

5 小結與展望

自從植物HSFs被發現能調控植物應對高溫脅迫開始，人們對其結構和功能機制有了更深入的研究，并且發現HSFs還參與調控植物對其他非生物脅迫和生物脅迫的抗性。該文綜述了HSFs的典型結構，以及水稻HSFs的相關研究進展，發現HSFs參與水稻對溫度、鹽堿度、濕度、病害等多種非生物和生物逆境的響應。但縱觀近年的研究進展，發現對水稻HSFs的研究主要以高溫脅迫為主，且多為對單一脅迫的影響，而對其在病蟲害生物脅迫方面的功能研究甚少。

由于對HSFs的功能研究目前還不夠全面，可以從以下幾方面展開進一步研究：（1）運用基因敲除、基因突變、超表達和RNAi等技術對HSFs在水稻病蟲害生物脅迫響應中的作用機理展開深入研究。（2）運用CHIP-Seq技術鑒定HSFs蛋白在全基因組上的結合位點，通過挑選不同通路中的差異性表達基因進行更深入的研究，了解其與HSFs的分子互作機理。（3）應用基因工程和分子育種技術，將能提高響應逆境脅迫的HSFs應用到水稻育種中，提高水稻的產量、對病原物的抗性和對非生物脅迫的耐受性。進一步闡明HSFs在不同類型的非生物脅迫與生物脅迫中的功能和信號途徑，有利于解析和完善植物抗病抗逆分子機制，并對水稻乃至其他作物抗病、抗逆育種中充分利用HSFs提高植物對逆境脅迫的耐受能力具有重要意義。