miR159-GAMYB途徑調控植物生長發育的研究進展

黎猛 陳躍 胡鳳榮

（1. 南京林業大學風景園林學院，南京 210037；2. 浙江省農業科學院園藝所，杭州 310000）

microRNA（miRNA）是一類在動植物中廣泛存在和在進化上保守的一段不具有開放性閱讀框、不編碼蛋白質的長度為20-24 nt的非編碼小分子RNA［1］。microRNA的生物合成通過轉錄、加工成熟和功能復合體裝配3個步驟完成，先后形成初級miRNA（pri-miRNA）、前 體miRNA（pre-miRNA）和雙鏈片段miRNA（miRNA/miRNA*），最后miRNA與AGO蛋白結合成RISC沉默復合物來完成功能調控［2］。microRNA主要通過調控下游的靶基因來發揮作用，其與靶基因的mRNA互補配對來切割mRNA或者抑制mRNA翻譯［3］，此外microRNA還可以調控基因的甲基化［4-5］。眾多研究表明，microRNA廣泛參與植物生長發育、信號傳導、逆境脅迫響應等多個生命過程［6］，因此研究microRNA的機理、生物學功能等具有重要意義。

microRNA159（miR159）家族是一類普遍存在于雙子葉植物和單子葉植物中的長度為21 nt的古老microRNA家族［7］。作為一類高度保守的microRNA，大量植物的小RNA測序實驗揭示，miR159是植物中表達量最多的一類microRNA［7］。MYB轉錄因子家族是最大的轉錄因子家族之一，具有MYB結構域的轉錄因子叫做MYB轉錄因子，其N端是高度保守的MYB結構域，根據該結構域R結構的個數和重復種類分為4類：（1）1R-MYB（R1/2，R3），（2）R2R3-MYB，（3）3R-MYB（R1R2R3-MYB）和（4）4R-MYB［8-9］，其中R2R3-MYB轉錄因子是MYB轉錄因子家族中數量最多的［10］。研究表明一類編碼R2R3 MYB轉錄因子的GAMYB基因是miR159主要的靶基因，因為這類MYB基因在大麥種子糊粉中響應GA信號，該基因編碼的MYB轉錄因子可以激活GA信號下游的α-淀粉酶基因和水解酶基因等基因的表達，所以這類MYB基因又叫“GAMYB”［11］。

miR159調控GAMYB在植物營養生長、開花誘導、雄性生殖、花器官發育、植物育性、果實發育和脅迫響應中有著重要作用，目前基于miR159-GAMYB途徑的研究在擬南芥中較為深入，在水稻、黃瓜、葡萄、大麥、草莓、大巖桐、煙草等植物中也有進展，本文總結了近些年來miR159-GAMYB途徑調控植物生長發育和脅迫響應的相關研究，為今后相關研究提供參考。

1 miR159-GAMYB表達調控模式

在模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，MIR159基 因 家 族 包 括MIR159a、MIR159b、MIR159c三種，其編碼的3種成熟miR159（miR159a、miR159b、miR159c）序列相差1-2個堿基，其中，miR159a與miR159b相 差1個 堿 基，miR159a與miR159c相差2個堿 基［12］。研 究表明miR159a和miR159b是擬南芥miR159家族成員中表達量最高的，有著相同的表達模式且廣泛分布于植株各部位，尤其是在芽和根部分生組織中，但是在花藥中缺乏，在種子中表達較弱；miR159c表達非常弱，主要分布在花藥和頂芽區域［12-14］。

在 擬 南 芥 中 有7個GAMYB-like基 因，包括MYB33、MYB65、MYB81、MYB97、MYB101、MYB104、MYB120［15-16］，其 中 除MYB104尚 沒 有功能報道外，其余的GAMYB-like基因在擬南芥生命活動中有著重要作用，這些GAMYB-like基因有著保守的miR159結合位點，生物信息學分析和5'-RACE分析表明它們是miR159的靶基因［14］，而降解組測序表明MYB33和MYB65是miR159的主要靶 基 因［16-17］，對MYB33和MYB65的mRNA結 構分析發現MYB33/65的miR159結合位點旁有獨特的二級結構［18］，而其他GAMYB-like基因沒有，這種結構有助于miR159沉默MYB33/65。組織表達分析發現MYB33和MYB65在全株都有大量表達，MYB81/97/101/120主 要 在 花 藥 中 表 達［13，19］，而miR159在花藥中表達很弱，miR159和GAMYB的這種組織表達差異［20］對于擬南芥生長發育有著重要意義。

在水稻中，Os-miR159a和Os-miR159b有著相同的成熟序列，其靶基因包括1個GAMYB基因和2個GAMYB-like（OsGAMYBL1和OsGAMYBL2）基因，Os-miR159在葉子和花中都表達，3個OsGAMYB同源基因在葉中的表達顯著高于花中，且OsGAMYB和OsGAMYBL1的 表 達 顯 著 高 于OsGAMYBL2［21］。5'-RACE表 明Os-miR159裂 解OsGAMYB和OsGAMYBL1，不 裂 解OsGAMYBL2，miR159調 控GAMYB機制存在于水稻葉和花中［21］。

miR159裂解靶基因GAMYB來發揮調控功能的機制廣泛存在于植物中，miR159-GAMYB途徑在植物中高度保守，miR159調控其他靶基因途徑在植物中并不具有保守性［22］。

2 miR159-GAMYB調控植物生長發育

2.1 miR159-GAMYB調控植物營養生長

在擬南芥營養組織中，MYB33和MYB65大量轉錄，miR159通過裂解MYB33和MYB65來保證擬南芥的正常生長，研究表明MYB33和MYB65的表達會帶來多種生長缺陷，包括生長延緩、株型矮小、葉子卷曲等。在擬南芥T-DNA功能缺失突變 體mir159ab中，MYB33和MYB65的 表 達 量 上升［13］，出現了多種表型缺陷包括生長延緩、葉子卷曲、角果和種子變小、種子畸形等［13-14，19］，通過突變MYB33的miR159結合位點構建mMYB33擬南芥，發現mMYB33擬南芥也出現了與mir159ab擬南芥相似的表型缺陷［13，23］。在更進一步的研究中構建了T-DNA myb33myb65mir159ab四突變體，結果表明所有mir159ab雙突變體的表型缺陷在myb33myb65mir159ab四突變體中都受到抑制［13］。細胞學上觀察mir159ab擬南芥的莖尖組織和葉組織發現，mir159ab擬南芥莖尖分生組織變得肥大，葉片的葉肉細胞數量顯著減少，葉表皮細胞尺寸變小和數量減少，說明MYB33和MYB65的表達抑制了細胞的增殖［13］。分子層面分析表明mir159ab擬南芥中MYB33和MYB65的解除導致蓮座葉和花組織中與糊粉相關的基因上升，包括一些水解酶和細胞程序性死亡（PCD）相關的基因，如CP1（CYS PROTEINASE1），GASA1（GA-REGULATED GENE1），DMC1（DISRUPTED MEIOTIC CONTROL1），BLX1（BETAXYLOSIDASE1）和BXL2，但是利用臺盼藍染色發現蓮座葉中MYB33和MYB65的表達并沒有促進細胞程序性死亡［13］。這些研究表明MYB33和MYB65的表達對擬南芥營養生長有害［13］，而miR159通過裂解MYB33、MYB65來維持擬南芥正常營養生長。同樣，利用人工microRNA靶基因模擬技術構建抑制miR159活性的MIMIC159（MIM159）擬南芥，結果MIM159擬南芥出現植株矮小、葉子上卷變圓、節間縮短等營養生長缺陷［24-26］，說明miR159的表達對擬南芥營養生長至關重要。

在 水 稻（Oryza sativa）中miR159-GAMYB調控水稻營養生長。Zhao等［27］利用STTM（short tandem target mimic）技術構建了抑制miR159活性的STTM159水稻，結果表明在STTM159水稻中2個miR159的 靶 基 因OsGAMYB1和OsGAMYBL1（GAMYB-LIKE 1）表達上升，STTM159水稻表現一系列生長缺陷包括植株高度變小，葉、圓錐花序尺寸變小、節間縮短等。對莖和葉脈橫截面觀察發現，野生型水稻莖比STTM159水稻莖具有更多的小維管束細胞，葉具有更多的小葉脈。GO（gene ontology）富集分析表明在STTM159水稻7 000多個基因中，關于細胞周期、生長、信號傳導等基因受到負調控，關于生物脅迫、細胞程序性死亡、營養素水平反應的基因受到正調控。在MIM159水稻中，OsGAMYB1和OsGAMYBL1的表達上升，出現了與MIM159擬南芥相似的表型缺陷，包括植株矮小，生長延緩，劍葉短小等［21］。

Zheng等［21］對另一種模式植物煙草（Nicotiana tabacum）進 行 探 究 發 現，MIM159煙 草 中3個NtGAMYB（NtGAMYB1、NtGAMYB2、NtGAMYB3）同源基因表達量上升，出現了與MIM159擬南芥相似的表型缺陷，包括株型矮小、葉子更小更皺等，對NtGAMYB基因進行煙草遺傳轉化發現，35S-NtGAMYB2煙草無明顯發育表型缺陷，而35S-mNtGAMYB2（miR159結合位點突變）煙草出現了與MIM159煙草相似的表型缺陷，表明miR159裂解調控NtGAMYB來發揮作用。利用GO富集分析發現MIM159煙草中有關脅迫響應、細胞程序性死亡的基因表達上升，有關形態學、細胞周期、細胞大小相關的基因表達下降。這些實驗驗證了GAMYB對營養生長的抑制功能，表明miR159通過裂解NtGAMYB來保證煙草正常的營養生長。

Kim等［28］對楊樹（Populus alba×P.tremula var.Glandulosa）GAMYB-like基 因PtrMYB012進 行 擬 南芥異源表達轉化，結果表明35S：PtrMYB012過表達的擬南芥蓮座葉上卷、矮小和雄性不育，這與mMYB33擬南芥和mir159ab擬南芥的表型缺陷相似，但是35S：PtrMYB012楊樹沒有明顯的表型缺陷，說明PtrMYB012被楊樹的miR159裂解但是不被擬南芥的miR159裂解。對煙草、水稻和日本落葉松（Larix kaempferi）GAMYB基因進行擬南芥異源過表達轉化，發現mNtGAMYB2擬南芥、mOsGAMYB擬南芥和mLaMYB33擬南芥這些過表達株系同樣出現了與mMYB33擬南芥一樣的表型缺陷，包括生長嚴重遲緩、植物矮小、葉子卷曲等［21］，在這些株系中，CP1的表達顯著上升，表明了GAMYB在不同植物中激活了相似的下游基因。

以上研究表明，GAMYB的表達對植物營養生長有諸多害處包括生長遲緩矮小、葉子卷曲等且這種功能是保守的［21］，miR159通過裂解調控GAMYB來保證植物的正常營養生長。但是這種功能在一些植物中還存在差異：在MIM159番茄（Solanum lycopersicum）中，miR159的 靶 基 因SlGAMYB1和SlGAMYB2表達量上升，MIM159番茄比野生型番茄植株更高，推測GAMYB可能促進莖的伸長［29］，這與之前水稻［30-31］中研究相似；在35S：MIM159大巖桐（Sinningia speciosa）中，SsGAMYB表達量顯著上升，但并沒有表現出營養生長上的缺陷［32］；Hou等［33］從青菜（Brassica rapa ssp. Chinensis）中分離1個GAMYB基因BcMYB101，BcMYB101在青菜葉、葉柄、根和花器官中高表達，BcMYB101異源過表達擬南芥表現為擬南芥葉子下卷、蓮葉數變多，而通過病毒誘導基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）技術沉默BcMYB101導致青菜葉子上卷。

在 擬 南 芥 根 中，MYB65促 進 細 胞 增 殖［34］。mir159ab雙突變體中，MYB33、MYB65、MYB101表達量上升，mir159ab雙突變體比野生型的根更長、分生組織更大、分生區和伸長區的細胞更多更長，且mMYB33/mMYB65/mMYB101擬南芥都表現出與mir159ab擬南芥根相似的特征，這些表明miR159通過裂解MYB33、MYB65、MYB101進而抑制主根生長［34］。

擬南芥GAMYB對根生長具有促進作用，包括促進根伸長生長和細胞增殖；而在其他營養組織中GAMYB具有強烈的抑制作用，包括抑制植株生長和莖葉細胞增殖，這其中的機理還需要進一步探究，同時miR159-GAMYB途徑在根中的功能研究還需在其他植物中擴展。

2.2 miR159-GAMYB調控植物花藥發育

花藥是雄蕊的重要組成，位于花絲頂端，膨大呈囊狀。植物花藥發育主要分為兩個階段，第一階段由雄蕊原基開始發育，經過組織特化、減數分裂形成完整的花粉囊壁，從外到內依次是表皮層、纖維層、中層和絨氈層，在藥室中心分布著小孢子的四分體結構；第二階段花藥繼續膨大，花絲伸長，小孢子由四分體結構發育成花粉粒，花粉囊開裂釋放花粉，進而完成授粉受精過程［35］。花藥及花粉能否正常發育關系到植物是否可育，因此花藥和花粉對植物生命過程有著至關重要的作用。

2.2.1 miR159-GAMYB調控擬南芥花藥和花粉發育 在擬南芥花藥中，miR159家族中只有miR159c在花藥中少量表達，研究表明MIR159c不是1個假基因，但是活性非常弱其作用可以忽略［14］，而GAMYB-like基因主要在花藥中表達［13，19］，這種組織表達差異對擬南芥花藥發育至關重要。

絨氈層是花粉囊最內層的由花藥次級壁細胞分化而成的特殊體細胞，包圍著小孢子，絨氈層在小孢子從四分體釋放后開始降解，在花粉成熟時期完全降解。它在花藥和花粉的發育中發揮著重要作用：為孢子母細胞提供營養物質；合成分泌孢粉素到花粉壁上，增強花粉的穩定性；合成并分泌可以分解四分體的胼胝體外壁的胼胝體酶，從而四分體釋放小孢子。絨氈層的降解是一個細胞程序性死亡的過程，調控絨氈層細胞程序性死亡的一些基因的突變常會使絨氈層不能正常降解，從而使花藥不能正常發育，最終導致雄性不育。

Millar等［23］發現擬南芥MYB33和MYB65調控絨氈層細胞程序性死亡，myb33myb65雙突變體在花粉母細胞階段花藥的絨氈層腫大導致花粉減數分裂前的敗育，但是在高光強和低溫條件會減少敗育，myb33或myb65單突變體沒有花藥表型缺陷，說明MYB33和MYB65在花藥發育上功能冗余。在35S：miR159a過表達擬南芥中也出現了雄蕊不育表型缺陷，花藥不能釋放花粉。

胞質分裂同時植物在雄性減數分裂末期Ⅱ以后，子核胞質區域會形成輻射狀微管系統（radial microtubule arrays，RMAs），調節胞質向心收縮進而促進細胞分裂。研究表明擬南芥MYB33和MYB65還可以影響雄性減數分裂Ⅱ時期的輻射狀微管排列的形成和胞質分離，在myb33myb65雙突變體中，減數分裂胞質分離異常并產生二倍體花粉粒和缺少富含蛋白的細胞外壁，導致花粉壁形態異常，而myb33或myb65單突變體并無此表型缺陷，說明MYB33和MYB65雄性減數分裂上功能冗余［36］。

植物的精細胞譜系發育過程是一個獨特重要的生命過程，在此過程中，單倍體小孢子經過不對稱有絲分裂產生一個較大的營養細胞和一個包裹其中的較小的生殖細胞，然后生殖細胞繼續分裂形成兩個精細胞。最近的研究表明MYB81可以促進雄性小孢子發育，Oh等［37］發現擬南芥myb81突變體的花粉有一半異常，其小孢子不能進行有絲分裂第一階段過程，在極化階段就中止了，進一步分析發現MYB81作為GAMYB轉錄因子促進有絲分裂第一階段和兩個雄性細胞譜系形成，對擬南芥的雄性小孢子發育和性成熟至關重要。

花粉管是從花粉萌發孔伸出而形成的管狀結構，花粉粒的內壁通過花粉外壁上的萌發孔或溝向外伸出的細管進而形成花粉管，其主要作用是將其攜帶的精子和其他內容物運至卵器或卵細胞內，來完成受精作用。研究表明擬南芥MYB97、MYB101、MYB120影響花粉管感應雄配子，MYB97、MYB101、MYB120主要在成熟花粉粒中表達，在成熟花粉中，MYB97、MYB101、MYB120的表達量明顯高于其他幾類GAMYB基因且它們有著相同的表達模式［38］，三 突 變 體（myb97-1 myb101-1 myb120-3，myb97-1 myb101-2 myb120-3 和myb97-1 myb101-3 myb120-3）擬南芥比野生型擬南芥有著更小的角果（這些角果中有許多不育的胚珠）和更低的結實率，雄配子有缺陷［35］，且其花粉管不能釋放精細胞到胚中，進一步的研究表明MYB97、MYB101、MYB120調控下游花粉管基因的表達（這些基因有關于糖類活性酶、小蛋白、轉運蛋白的合成［39］），進而影響花粉管感應雄配子和花粉管細胞促進花粉管分化釋放精細胞［38-39］，任何一個單突變體或者雙突變體都沒有出現花粉表型缺陷，說明MYB101、MYB104、MYB120在花藥發育上功能冗余［38-39］。

植物受精是植物有性生殖的核心環節，miR159-GAMYB途徑在這一過程中對中央細胞受精發育有著重要的作用，影響植物的育性和種子發育。中央細胞是胚囊的組成細胞之一，是一個大型的液泡化細胞，內含二核叫做極核，受精的中央細胞又稱“受精極核”，中央細胞在受精后發育為胚乳。Zhao等［40］發現mir159abc擬南芥的中央細胞不能正常分裂而導致結實率降低，在受精前，擬南芥胚囊中央細胞的MYB33和MYB65表達量很高；在受精后，野生型擬南芥中央細胞MYB33和MYB65表達很低，mir159abc擬南芥中央細胞MYB33和MYB65表達依舊很高，且mir159abc擬南芥與mMYB33擬南芥一樣，胚乳核分裂受到明顯抑制。這些說明花粉中的miR159傳輸到中央細胞來降解MYB33和MYB65進而促進胚乳核分裂。

2.2.2 miR159-GAMYB調控其他植物花藥和花粉發育 在其他植物花藥中，GAMYB的正常表達對于花藥的正常發育有著重要作用，miR159通過調控GAMYB進而調控花藥發育。

在水稻花藥中，miR159和OsGAMYB共表達，miR159對OsGAMYB的表達起著微調（fine-tune）的作用，在花藥發育期間miR159a水平下降導致其2個靶基因OsGAMYB和OsGAMYBL1表達上升［30］。水稻花藥中，miR159-GAMYB影響烏氏體和外孢壁的發育。烏氏體是花藥絨氈層內表面上的一種僅數微米大小的顆粒物，烏氏體參與絨氈層壁的降解、花粉外壁的形成、識別蛋白的轉運等，對花粉的發育有著重要作用。研究表明水稻gamyb突變體花器官發育異常尤其是花藥，表現為絨氈層不能正常程序性死亡、烏氏體和外孢壁有缺陷，從而導致雄蕊不育，更進一步的分析表明GAMYB結合在CYP703A3基因的啟動子上來促進其在花藥發育中的表達，從而保證烏氏體和外孢壁的正常形成［41］。

植物花藥的開裂保證成熟花粉的釋放，以完成授粉受精過程。花藥壁組織的脫水、酶解和花藥藥室內壁的次生加厚等過程都會影響花藥的開裂，其中藥室內壁的次生加厚為花藥開裂提供一種機械力量，對花藥開裂至關重要。侯丹［42］對毛竹（Phyllostachys edulis）的PhemiR159進 行 擬 南芥過表達發現過表達擬南芥花藥內皮層缺乏次生加厚、裂口區缺少機械外力而無法開裂，qRT-PCR結果表明與擬南芥花藥開裂相關的MYB26、NST1（NAC SECONDARY WALL THICKENING PROMOTING FACTOR1）、NST2 等基因的表達量在超表達株系中均發生顯著變化，推測毛竹PhemiR159可能通過負調控擬南芥AtMYB33來調節這些次生加厚相關基因的表達，從而影響PhemiR159過表達擬南芥株系的花藥開裂。

糖是植物光合作用的產物和呼吸作用的底物，葉片光合作用產生的碳水化合物通過韌皮部轉運到植物的各個部分，為其生長發育提供碳和能量，如花藥發育、花粉管萌發、種子果實的膨大成熟等。研究表明在番茄中GAMYB可以調控糖類代謝基因進而調控花藥發育，Zhang等［43］利用RNAi技術沉默番茄中的GAMYB-like基因SlMYB33，發現SlMYB33-RNAi番茄出現花粉成熟異常并導致低育性，進一步分析表明SlMYB33-RNAi番茄花粉中有關于蔗糖、淀粉代謝和糖類運輸的基因表達受到抑制。

胡 紫 蔚［44］構 建 了 白 菜（Brassica campestris）MIR159a和MIR159c過表達載體，遺傳轉化菜心，結果發現過表達35S：MIR159a白菜和35S：MIR159c白菜都會引起花粉敗育，且花粉敗育都是由于花粉粒內含物降解導致花粉內壁消失，進而引起花粉皺縮，不過白菜過表達MIR159a和 MIR159c植株花粉出現敗育的時期不同，過表達MIR159a白菜產生的花粉敗育比例要高于過表達MIR159c白菜，且過表達MIR159a白菜的花粉管萌發異常［44-45］。

在黃瓜中，GAMYB可以調控雌雄花的比例，利用RNAi技術沉默黃瓜中的CsGAMYB1，結果為CsGAMYB1-RNAi黃瓜雄花和雌花的比例降低［46］，黃瓜CsGAMYB1在擬南芥中異源過表達會導致擬南芥雄性不育［46］。

過表達HvGAMYB會導致大麥花粉不育，花藥體型變大、顏色更亮［47］。在小麥Ubi∷TamiR159異源過表達水稻中，表現為育性降低，花藥中無花粉，但Ubi∷TamiR159水稻中絨氈層能夠正常分解，其雄性不孕花粉不能正常產生的原因還不清楚［48］。

2.3 miR159-GAMYB調控種子萌發和果實發育

2.3.1 miR159-GAMYB調控種子萌發 糊粉粒是植物細胞內儲藏蛋白質的結構，每個糊粉粒是一個液泡，其中儲藏大量蛋白質。糊粉粒可以轉運養分和積累營養物質，在種子萌發中，糊粉開始細胞程序性死亡，為種子萌發提供營養和水解酶，禾本科植物種子的糊粉粒集中在胚乳的外層細胞中，形成糊粉層。GAMYB早期被發現在大麥糊粉中調控細胞程序性死亡［26，49］，這一功能后來在擬南芥、水稻都被證實。

在擬南芥種子中，MYB33、MYB65、MYB101促進糊粉的細胞程序性死亡，研究表明在myb33myb65myb101三突變體中出現了糊粉細胞空泡化，同時對mir159ab雙突變體擬南芥營養組織中進行深入探究，發現MYB33和MYB65的解除導致了有關糊粉的基因表達上升，包括一些水解酶和細胞程序性死亡相關的基因，如CP1、CP、GASA1、BXL1和BXL2，這些基因在myb33myb65myb101三突變體的種子中表達都下降了［19］。值得注意的是，miR159在擬南芥種子和GAMYB共表達，研究表明隨著種子萌發MYB33的表達水平逐漸降低，miR159的活性處于衰減狀態，miR159對MYB33的表達只是微調的作用［50］。在水稻種子中，OsGAMYB促進糊粉細胞的細胞程序性死亡，不過在水稻中，miR159的表達很低并不參與調控OsGAMYB［14］。番茄的GAMYB-like基因LeGAMYBL1在種子的胚和胚乳中表達，并且在種子萌發中表達量上升［51］。

2.3.2 miR159-GAMYB 調控果實發育 miR159-GAMYB在番茄和葡萄中可以促進單性結實。在番茄中，miR59和SlGAMYB在開花前的子房中共同表達，SlMIR159過表達導致SlGAMYB表達下降，并致使果實早熟單性結實［29］。在葡萄中，外源GA處理促進葡萄單性結實，并且GA處理使VvmiR159c受到正調控，VvGAMYB受到負調控［52］。

miR159-GAMYB可以調控草莓花托的發育。在草莓花托發育不同階段，草莓的Fa-MIR159a、Fa-MIR159b表現為不同程度的表達，且與它們的靶基因FaGAMYB呈負相關［53］。Vallarino等［54］用RNAi沉默草莓中的FaGAMYB，發現FaGAMYB-RNAi草莓中FaGAMYB下降并且花托成熟中止，顏色形成受到抑制。

在番茄中，GAMYB可以促進果實增大。研究表明，SlMYB33-RNAi番茄比野生型的番茄果實更小［43］。對番茄SlGAMYB進行過表達轉化，發現SlMYB33過表達番茄的果實更大［55］。

2.4 miR159-GAMYB調控植物開花

植物開花誘導受內源因素和外源因素共同影響，主要受光周期途徑、春化作用、自主途徑和赤霉素途徑四大途徑的影響，這些途徑最后都匯 聚 于LFY（LEAFY）、SOC1（SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO1）、FT（FLOWERING LOCUS T）等調節因子的轉錄上。miR159-GAMYB途徑在植物開花誘導上的功能目前還尚有爭論［18］。

在擬南芥中，MYB33可以結合在LFY的啟動子上來激活其表達并促進開花［56］，35S：miR159a過表達擬南芥（Landsberg型）在短日照（SD）下延遲開花，花中的MYB33和LFY表達下降，推測是MYB33調控LFY下降從而延遲開花［57］；小麥Ubi∷TamiR159異源過表達水稻開花延遲［48］；在葡萄中通過外源性GA處理實驗表明miR159裂解VvGAMYB進而抑制VvGAMYB下游的VvLFY的表達來抑制開花［58］；在大巖桐中miR159調控GAMYB影響了其下游有關開花的SsLEAFY和3個MADS-box基因即SsAP1（APETALA1），SsAP3，SsAG基因的表達，在短日照條件下35S：miR159a過表達導致大巖桐開花延遲，35S：MIM159中miR159被抑制則導致大巖桐開花提前［32］；在番茄中，SlMYB33-RNAi番茄表現為開花延遲［43］。這些表明GAMYB促進植物開花，而miR159通過抑制GAMYB進而抑制植物開花。

然而，Schwab等［59］發現35S：miR159a過 表達擬南芥（Columbia型）花中沒有表現MYB33、MYB65的水平降低，且沒有開花時期的變化。在短日照下mir159ab擬南芥（Columbia型）表現為開花延遲（可能有mir159ab擬南芥營養生長缺陷的影響），myb33myb65擬南芥開花時間與野生型一樣，這些說明MYB33和MYB65并不會促進或者是抑制開花［19］。MIM159煙草與mir159ab擬南芥一樣表現為植株矮小、葉片又小又皺等營養生長缺陷和開花延遲［21］。mMYB33擬南芥和外源性赤霉素處理野生擬南芥（Landsberg型）導致的MYB33過表達只是輕微提前開花［57］。張波等［55］對番茄SlGAMYB進行過表達轉化，發現SlGAMYB過表達番茄開花延遲，推測可能是因為劑量效應，即SlGAMYB的過量會起到反效果。以上這些說明GAMYB可能抑制開花，這與GAMYB普遍表現為促進開花相矛盾。

miR159-GAMYB在開花調控中存在較大差異，尤其是GAMYB的功能差異，這可能是亞型的差異、其他調控機制［60］的影響或是其他原因還尚不得知。植物開花誘導是一個及其復雜的調控過程，miR159-GAMYB調控植物開花誘導的分子機理還需進一步研究。

在 擬 南 芥［24-25］和 大 巖 桐［32］中，miR159-GAMYB途徑還調控植物花器官發育。這些說明，miR159-GAMYB途徑對植物生長發育的各個過程有著重要作用（表1），因此研究miR159-GAMYB的調控機理、生物功能等有著極高的價值、意義和廣泛的前景。

表1 miR159-GAMYB途徑調控植物生長發育研究進展Table 1 Research progress of miR159-GAMYB pathway regulating plants growth and development

3 miR159-GAMYB途徑參與植物逆境脅迫響應

3.1 miR159-GAMYB參與植物生物脅迫響應

miR159-GAMYB途徑響應病原菌感染。最近的研究發現在百合（Lilium regale）中，Lre-miR159a抑制其靶基因LrGAMYB來響應植株抵御灰霉菌（Botrytis elliptica），對擬南芥進行異源過表達發現Lre-MIR159a擬南芥比野生型和LrGAMYB擬南芥（比野生型對灰霉菌感染更敏感）對灰霉菌有更強的抵御能力，Lre-MIR159a擬南芥中MYB33/65的水平下降，進一步分析發現Lre-MIR159a擬南芥中茉莉酸和水楊酸相關的基因表達上升，包括AtPR1（ATHOGENESIS-RELATED PROTEINS），AtPR2，AtNPR1（NONEXPRESSOR OF PATHOGENESISRELATED），AtPDF1.2（PLANT DEFFINSIN1.2）和AtLOX（LIPOXYGENASE）［61］。在煙草中，miR159-GAMYB響應疫霉菌（Phytophthora parasitica）感染，Zheng等［21］發現MIM159煙草比野生型顯著增強了對疫霉菌的抵抗力，進一步分析發現MIM159煙草和mNtGAMYB煙草葉片中關于防御響應的PRs等基因顯著上升，但是在MIM159擬南芥、MIM159水稻和mGAMYB（mAtMYB33、mOsGAMYB、mLaGAMYB和mNtGAMYB）擬南芥中PRs基因并沒有明顯變化，說明這種脅迫的分子調控機制并不具有保守性。

miR159-GAMYB途徑響應根結線蟲。植物受病原刺激或蟲害而出現的局部增生叫做蟲癭，感染根結線蟲擬南芥的根部蟲癭中miR159表達上升，MYB33∷GUS只在蟲癭早期表達而在后期則無表達，說明了miR159調控MYB33響應根結線蟲，并且擬南芥mir159abc三突變體能顯著增強對根結線蟲的抵抗力［62］。miR159-GAMYB響應根結線蟲的機理還需深入研究。

病毒感染可以破壞擬南芥miR159的活性并造成與mir159ab擬南芥相似的生長缺陷。研究表明非洲木薯（Manihot esculenta）花葉病毒編碼的AC4蛋白［63］和黃瓜花葉病毒編碼的CMV（Cucumber mosaic virus）2b蛋白［64］可以與擬南芥miR159相結合，阻 止miR159對MYB33和MYB65的 調 控，MYB33和MYB65的表達上升。Li等［65］用編碼沉默抑制蛋白P0的病毒構建了35S-P0過表達擬南芥，發現35S-P0擬南芥表型與mir159ab相似，進一步研究發現蓮座葉中MYB33/65表達上升，但是表達量只有幾倍上升，說明病毒蛋白的沉默效果不是很強。

3.2 miR159-GAMYB參與植物非生物脅迫響應

miR159-GAMYB響應干旱脅迫。在種子萌發中，ABA水平下降來促進種子萌發成苗，研究表明ABA-miR159-GAMYB通路影響種子萌發，在干旱條件下，擬南芥種子中miR159響應ABA并且表達量上升，MYB33和MYB101水平下降，進一步研究發現MYB33和MYB101對ABA敏 感，而miR159通過抑制MYB33和MYB101來響應非生物脅迫，進而影響種子萌發［66］。在馬鈴薯（Solanum tuberosum）中，干旱脅迫下miR159表達下降GAMYB表達上升［67］。對 小 麥 的miR159和TaGAMYB1進 行 水 稻異源過表達，發現Ubi∷miR159水稻比野生型對干旱脅迫更敏感，表現為植株枯萎和生長緩慢，而Ubi∷mTaGAMYB1水稻無明顯變化，說明小麥

miR159裂解水稻OsGAMYB參與干旱脅迫響應，進一步研究發現，myb33myb65擬南芥在干旱脅迫下與Ubi∷miR159水稻的表型相似，對干旱脅迫敏感［48］。這些說明miR159-GAMYB途徑響應干旱脅迫在植物間并不具有功能保守性。在鹽脅迫下，miR159的響應在不同植物間也出現了差異［68］，這其中的機理尚不清楚。

miR159在擬南芥營養組織中強烈沉默MYB33/65，且這種機制不受任何脅迫的影響。在ABA、干旱、寒冷、高溫等脅迫下，mir159abmyb-33myb65擬南芥與野生型一樣無響應，而且進一步研究表明這些脅迫無法抑制野生型擬南芥miR159從而使MYB33和MYB65表達［65］。擬南芥營養組織中miR159-GAMYB途徑響應非生物脅迫的機理還尚不清楚。

4 miR159-GAMYB調控體系

miR159-GAMYB途徑在植物中高度保守，miR159通過裂解靶基因GAMYB在植物生長發育、逆境脅迫、信號傳導等有著重要作用。然而越來越多的研究表明，miR159-GAMYB還與其他眾多途徑相互影響，比如脫落酸（ABA）［66］、赤霉素（GA）等激素的調控，與其他microRNAs間的聯合互作，GAMYB-likes間的二級調控［14］等。這對全面了解miR159-GAMYB途徑的功能和機理有著重要作用。

4.1 GA-miR159-GAMYB信號通路

赤霉素（gibberellins，GAs）是一種普遍存在于高等植物的二萜羧酸類化合物，是一類重要的植物激素，目前發現的100余種赤霉素中只有少量具有活性，如GA1、GA3、GA4、GA7等［69］。赤霉素幾乎參與植物所有的生長發育過程，包括種子萌發、幼苗生長、根莖葉的伸長生長、花期、花器官發育和果實成熟等［70］。近些年分子生物學的發展表明GA信號通路的主要調控路徑為GA-GID1-DELLA［71-72］，這種模式在維管束植物中是高度保守的［71］，其中GID1（GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1） 是GA的受體蛋白，DELLA蛋白是一類阻遏蛋白，屬于GRAS蛋白家族且廣泛分布于植物中，是GA信號中的抑制子。擬南芥基因組中含有5個DELLA蛋 白 成 員，分 別 是GA-INSENSI-TIVE（GAI）、REPRESSOR-OF-GAL-3（RGA）、RGA-LIKE1（RGL1）、RGL2和RGL3，水稻中只有1個DELLA成員，即SLENDER RICE1（SLR1）［73］。GA通 過GID1蛋 白和DELLA蛋白結合成GA-GID1-DELLA三聚體復合物，從而調控植物生長發育。當GA濃度較低時，受體GID1不與GA結合，DELLA蛋白則與調控植物生長發育的轉錄因子結合，抑制植物生長發育。當GA濃度較高時，GA-GID1-DELLA形成三聚體來抑制DELLA蛋白的阻遏作用，同時促進DELLA蛋白與泛素E3連接酶復合體（SCFSLY1/GID2）結合，導致DELLA蛋白泛素化，隨之被26S蛋白酶降解掉，從而消除DELLA蛋白對植物生長的抑制作用［74］。

4.1.1 GA-GAMYB信號通路 GAMYB與GA有著緊密的關系，因為在大麥種子中這類MYB基因編碼的MYB轉錄因子可以結合在GA信號下游基因（包括細胞程序性死亡、水解酶等相關基因）啟動子GARE元件中的TAACAA/GA序列上，進而激活這些基因的表達，所以命名為GAMYB［9］。GA-GAMYB途徑還存在擬南芥［19］和水稻［30，41］種子糊粉中，番茄種子胚、胚乳［51］和子房［29］中，擬南芥［36］、水稻［30，41］、大麥［47］等植物花藥中，黃瓜花芽［46］中，青菜［33］中等。但是在擬南芥營養組織中，GAMYB不響應GA信號，GAMYB不參與擬南芥GA信號調控開花［19］。

在種子糊粉細胞和花藥絨氈層中，GAMYB響應GA信號促進細胞程序性死亡。GA通過DELLA類蛋白進而調控種子和花藥中的GAMYB，包括擬南芥RGA、GAI蛋白［36］，水稻SLR1蛋白［30，41］，大麥SLN1（SLENDER1）蛋 白［47］等，GA-DELLAGAMYB通路表現為GA通過解除DELLA蛋白的抑制作用進而促進GAMYB的表達。在番茄子房中，GA可能通過生長素來調控SlGAMYB［29］。

Aya等［75］分析進化起源中GA與GAMYB的關系，發現GA調控通路可能起源于GAMYB調控通路，在苔蘚（Physcomitrella patens）（缺少GA信號通路）中，其GAMYB同源基因的敲除產生了不正常的孢子，不能形成雄性器官，而是形成異常的雄性器官；在中國石松（Selaginella moellendorffii）中，GA處理能夠促進小孢子外壁的形成，通過GA合成抑制則干擾其發育，由這種功能的相似性推測出GAMYB調控系統先于GA感應系統。

4.1.2 GA-miR159信號通路 miR159響應GA信號通路目前還存在很多差異，這其中包括不同種和不同品種間的差異和同一物種不同種類miR159的響應差異。

在水稻［30］和擬南芥［19］中，miR159不響應GA信號，但是葡萄［52，58，76-77］、草莓［53］、大麥［57］等植物的miR159響應GA信號。在葡萄品種（Vitis vinifera L.‘Wink’）中，GA處 理 導 致VvmiR159水平下降，VvGAMYB水平上升［77］，而在葡萄品種“醉金香”中，GA處理導致VvmiR159c水平上升，VvGAMYB水平顯著下降［52］。這些說明miR159響應GA信號存在物種間和品種間的差異。在‘白羅莎里奧’葡萄（Rosario Bianco）中，外源赤霉素處理后除VvmiR159b在果肉中被GA3上調表達外，VvmiR159a/c在果皮、果肉中被GA3處理后均下調其表達［76］。“醉金香”葡萄中，外源赤霉素處理發現VvmiR159c在整個開花期間表達上升，但是VvmiR159a/b卻無明顯變化［52］。在草莓花托中，VvGAMYB受到miR159b的調控，外源性GA處理導致Fa-MIR159a顯著降低，而Fa-MIR159b無明顯變化，VvGAMYB無明顯變化［53］。這些表明在同一物種中不同miR159響應GA信號有差異。

研究發現GA通過DELLA類蛋白調控miR159，這其中包括葡萄、大麥等植物。在葡萄中，外源赤霉素處理導致VvmiR159c表達上升，兩類編碼DELLA類 蛋 白 的VvSLR1和VvRGL1基 因 表 達 顯著下降，說明GA通過解除DELLA類蛋白來促進VvmiR159c表達［52］。在大麥中，GA解除DELLA蛋白SLN1的抑制作用來促進大麥miR159的表達［57］。

4.2 microRNAs聯合調控機制

miR159-GAMYB途 徑 與 另 一 種microRNA即miR319及其靶基因TCP（TEOSINTE BRANCHED1、CINCINNATA、PROLIFERATING CELL FATOR）有聯合互作關系。在擬南芥中miR159與miR319有高度的相似性，其21個核苷酸有17個核苷酸相同，miR319可以調控miR159的靶基因GAMYB，但是miR159卻不能調控miR319的靶基因TCP，不過miR319調控GAMYB的作用非常弱，而且相對于miR159在植株中廣泛大量表達，miR319在植株中表達豐度低且范圍小［14，78-79］，這也表明miR159在進化上與miR319的緊密關系［22，45］。在MIM159擬南芥中除植株矮小、葉子上卷變圓、節間縮短等表型缺陷外，還出現了花萼花瓣小發育不完整，花小，花藥發育不完整，并且這與MIM319擬南芥的表型缺陷相似［24-25］，進一步研究表明，TCP4和MYB33轉錄因子可以獨立或者互作形成異源二聚體激活MIR167A的啟動子，miR159和miR319通過抑制MYB33和TCP4進而抑制miR167的表達，從而促進miR167與花發育相關的靶基因ARF6/8（AUXIN RESPONSE FACTOR）的表達，進而調控植物花器官發育［25］，這說明了miR159-miR319-miR167聯合調控植物花器官發育。在番茄中，miR159-SlGAMYBmiR167-SlARF8調控子房發育和坐果［29］。

植物營養生長幼年向成年轉變是植物發育的重要過程之一，是植物開花生殖生長的基礎，植物的營養階段轉變受到保守的miR156-SPLs（SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE）途 徑 的 調控。研究表明miR156-SPL-miR172聯合調控植物營養階段轉變，在幼苗時期，miR156的表達非常高，miR172的表達非常低，隨著植物生長，miR156的表達逐漸降低，其靶基因SPL9和SPL10的表達上升，SPL9/10轉錄因子可以結合在miR172的啟動子上來激活其表達，miR172的表達上升，進而完成營養生長從幼年到成年的轉變［80］。Guo等［60］發現mir159ab擬南芥延遲了營養生長且miR156的表達量上升，進一步的研究表明miR159的靶基因MYB33可以結合在MIR159A、MIR159C及它們的靶基因SPL9的啟動子上來促進這些基因的表達進而調控植物的營養生長轉化，這些說明了miR159-MYB33可以調控下游的miR156和SPL基因發育來調控營養生長轉化。miR156-SPL途徑還可以調控植物由營養生長向生殖生長轉變［81］。這些為miR159-GAMYB途徑調控花期提供參考，比如mir159ab擬南芥花期延遲。

5 總結與展望

miR159-GAMYB途徑對植物生長發育（圖1）和脅迫響應有著重要意義，其中營養生長、雄性生殖、種子育性和萌發、果實發育和脅迫響應方面的調控對農作物高產和抗逆培育有著重要參考價值，花期調控、花器官發育和營養生長方面的調控為觀賞植物培育提供了新思路。目前基于此類的研究多在模式植物中開展，受限于轉基因遺傳轉化技術等條件的制約，在其他一些經濟作物和園藝觀賞植物中研究緩慢，這是今后研究的一個重要方向。

圖1 miR159-GAMYB途徑調控植物生長發育功能分析Fig.1 Function analysis of miR159-GAMYB pathway regulating plants growth and development

當下研究中miR159-GAMYB調控途徑還有很多爭論和問題：（1）擬南芥營養組織（不包括根）中MYB33/65的表達抑制營養生長，這其中引起了什么下游事件？激活了什么下游基因？miR159強烈裂解沉默MYB33/65來保證正常營養生長發育，這種看似多余的調控機制有何生物學意義？GAMYB在擬南芥根和莖葉中功能完全相反，這其中的機理是什么？（2）雖然眾多研究表明GAMYB抑制植物營養生長，但是GAMYB這種功能是否具有保守性？為什么MIM159番茄的植株更高、MIM159大巖桐無明顯營養生長缺陷？目前miR159-GAMYB調控植物開花還尚有很多爭論，GAMYB在開花誘導上的功能是什么？（3）miR159和GAMYB在擬南芥種子中共表達，miR159對GAMYB微調的機理是什么（這種微調作用也存在眾多其他植物組織中）？mir159ab擬南芥產生了畸形種子，miR159-GAMYB對畸形種子形成的調控機理是什么？（4）MYB33/65的mRNA獨特二級結構是如何讓miR159沉默MYB33/65？這其中的作用機制是什么？（5）目前miR159-GAMYB響應逆境脅迫的研究多是集中在形態學和簡單的分子學分析上，其中miR159響應逆境脅迫的機理還尚不明確。（6）miR159響應GA信號表現出巨大的差異，包括不同miR159的響應差異及組織和物種間差異，這種差異的分子機理是什么？有何生物學意義？

miR159-GAMYB調控途徑需要很多完善和補充，其中了解更多的miR159-GAMYB上下游基因、更多層次的調控網絡和完善準確的調控機理尤為重要。