胃腸間質瘤組織中第10號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物基因蛋白和磷酸化蛋白激酶B蛋白的表達及其對患者預后的影響

王 昊, 趙 偉, 石 磊

(江蘇省蘇北人民醫院/揚州大學臨床醫學院 胃腸外科, 江蘇 揚州, 225001)

胃腸間質瘤(GIST)是胃腸道最常見的間葉源性腫瘤，可發生在胃腸道的任何部位，最常見原發部位是胃[1-2]。GIST早期臨床表現無特異性，腫瘤進展隱匿且迅速，后期腫瘤轉移也較常見，多數GIST患者首次就診時已出現消化道出血、梗阻、穿孔等癥狀，此時腫瘤往往已發展至晚期[3]。因此，早期診治和評估預后仍是當前GIST的研究熱點。第10號染色體缺失的磷酸酶與張力蛋白同源物基因(PTEN)通過其磷酸酯酶蛋白產物行使抑癌基因作用，被稱為“后p53基因時代突變率最高的腫瘤抑制基因”。通過對磷脂酰肌醇3, 4, 5-三磷酸(PIP3)的去隣酸化調節，PTEN負性控制PI3-kinase/Akt信號轉導通路(該通路被認為是GIST最重要的存活通路之一)，從而起到促凋亡因子的作用[4]。

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋 白 激 酶 B (PKB或 Akt)信號通路作為細胞內重要的信號轉導通路之一，參與細胞周期調節、蛋白質翻譯和細胞程序性死亡調控等過程。該通路中的核心分子Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白雙功能激酶，其功能涉及細胞周期調控、惡性增殖、血管新生和侵襲轉移等諸多方面[5]。研究[6]發現, PTEN可抑制PI3K/Akt通路，降低磷酸化Akt(p-Akt)水平，從而發揮其抑癌基因的作用。對于PTEN和p-Akt在GIST中的表達意義的報道較少。本研究通過檢測GIST組織中PTEN蛋白、p-Akt蛋白的表達，并分析其與GIST患者預后的關系，探討二者對評估GIST患者預后的價值，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月—2017年1月在江蘇省蘇北人民醫院行手術(包括開放手術、腹腔鏡手術、內鏡手術)治療的GIST患者為研究對象。納入標準: ① 經病理和免疫組織化學確診為GIST者; ② 腫瘤組織危險度分級明確者; ③ 患者病歷資料完整。排除標準: ① 合并其他惡性腫瘤者; ② 嚴重肝功能不全(Child-Pugh C級) 者; ③ 慢性腎臟病(CKD)臨床分期標準4期及以上者; ④ 精神異常者; ⑤ 妊娠期及哺乳期女性; ⑥ 年齡<18周歲或>75周歲者。最終研究組納入116例GIST, 同時選取相對應的瘤旁正常胃腸道組織(與腫瘤組織距離>3 cm)116例為對照組。本研究通過蘇北人民醫院醫學倫理委員會批準(批件號: 2018KY-185)。

1.2 主要試劑

兔抗人PTEN單克隆抗體(產品批號9188P), 購自Cell Signaling Technology公司; 兔抗人p-Akt(Thr308)多克隆抗體(產品批號sc-16646-R), 購自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集：所有行GIST手術的患者手術時均留存病理組織(3 cm×3 cm), 并于液氮中速凍，之后凍存于-80 ℃冰箱中，待檢。

1.3.2 PTEN、p-Akt表達水平檢測：常規制作GIST組織和瘤旁正常組織石蠟切片(厚度為3～4 μm), 采用免疫組織化學法檢測組織中PTEN、p-Akt的表達水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，二氨基聯苯胺(DAB)顯色和蘇木精復染，然后在不同梯度乙醇(75%、85%、95%、100%)中脫水，最后用中性樹膠封片，顯微鏡觀察拍照。

1.3.3 結果判定：每個實驗結果均由2位病理科醫生在雙盲條件下完成評定。① 陽性強度評分: 無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。② 在顯微鏡下，按照陽性細胞所占百分率評分: ≤5%為0分, >5%～≤25%為1分, >25%～≤50%為2分, >50%～≤75%為3分, >75%為4分。③ 根據染色指數(即染色強度與陽性細胞所占百分率的評分乘積)將免疫組織化學結果進行等級劃分: 0～1分為陰性(-), 2～4分為弱陽性(+), 5～8分為中度陽性(), 9～12分為強陽性()。其中-和+記為PTEN、p-Akt陰性,和記為PTEN、p-Akt陽性。

1.4 隨訪

對入選患者進行為期3年的隨訪，隨訪起始時間為手術當天。隨訪計劃為術后第1年內每隔4個月囑患者入院復查1次(條件不允許的每半年復查1次)，術后第2、3年每6個月囑患者入院復查1次，記錄患者復發、腫瘤轉移及死亡情況。

1.5 統計學分析

2 結 果

2.1 PTEN和p-Akt在GIST和瘤旁正常組織中情況

PTEN、p-Akt免疫組化染色陽性強度評分結果見圖1、2。PTEN陽性表達為細胞漿和細胞核中出現棕黃色或棕褐色顆粒, p-Akt陽性表達為細胞漿和細胞核中出現棕黃色或棕褐色顆粒，見圖3。

PTEN在研究組中的陽性表達率低于其在對照組的陽性表達率，差異有統計學意義(P<0.05), 而p-Akt在研究組中的陽性表達率高于其在對照組中的陽性表達率，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 PTEN和p-Akt在GIST組織和瘤旁正常組織中的表達率比較

2.2 PTEN、p-Akt表達水平與GIST臨床病理特征的關系

116例GIST患者中，男64例，女52例，年齡22～70歲，平均(47.08±12.68)歲。GIST發生部位: 胃59例，直腸5例，空回腸35例，十二指腸17例; NIH危險度分級: 極低危和低危71例，中危和高危45例。PTEN、p-Akt在GIST組織中的表達情況與其病理性核分裂象、危險度分級、浸潤深度有關(P<0.05)，與患者的年齡、性別、腫瘤直徑無關(P>0.05)。見表2。

表2 PTEN、p-Akt表達水平與GIST臨床病理特征的關系[ n(%)]

2.3 GIST組織中PTEN、p-Akt的相關性分析

GIST組織中PTEN與p-Akt的表達呈顯著負相關(r=-0.635,P<0.001), 見表3。

表3 GIST中PTEN、p-Akt相關性分析

2.4 PTEN、p-Akt表達與GIST患者預后的關系

116例GIST患者中16例失訪，失訪率13.79%。Kaplan-Meier法單因素生存分析顯示: PTEN陽性GIST患者的無復發生存時間為(34.54±0.46)個月，長于PTEN陰性GIST患者的(29.34±1.0)個月，差異有統計學意義(t=32.420,P<0.001); Log-rank檢驗結果:χ2=8.941,P=0.003, 見圖4。p-Akt陰性GIST患者無復發生存時間為(34.83±0.40)個月，長于p-Akt陽性GIST患者(29.54±0.95)個月，差異有統計學意義(t=32.877,P=0.001); Log-rank檢驗結果,χ2=7.633,P=0.006, 見圖5。

2.5 影響GIST患者預后的危險因素分析

單因素分析表明，年齡、危險度分級、核分裂象、浸潤深度、PTEN陰性表達、p-Akt陽性表達情況均是影響GIST患者預后的因素(P<0.05)。

A: PTEN在GIST組織中細胞漿和細胞核的彌漫性強陽性表達; B: PTEN在GIST組織中細胞漿的弱陽性表達;C: p-Akt在GIST組織中細胞核的弱陽性表達; D: p-Akt在GIST組織中細胞漿和細胞核的彌漫性強陽性表達。

考慮到以上因素可能存在的交互作用，通過變量共線性分析，剔除危險度分級這一變量，將年齡、核分裂象、浸潤深度、PTEN陰性表達、p-Akt陽性表達5個變量納入Cox回歸，多因素分析表明，核分裂象、浸潤深度、PTEN陰性、p-Akt陽性表達均是導致GIST患者不良預后的危險因素(P<0.05)。見表4。

表4 影響GIST患者預后的危險因素分析

2.6 PTEN、p-Akt表達情況對GIST患者預后評估的價值

PTEN、p-Akt表達情況對GIST患者預后評估的敏感度、特異度、曲線下面積(AUC)見圖6、7和表5。

表5 PTEN、p-Akt表達情況對GIST患者預后評估的預測

3 討 論

近年來GIST的發病率呈明顯增高趨勢[7]。GIST多發生于胃部(約60%), 其次為小腸(25%～30%), 少數發生于結直腸[8]。GIST的主要治療方式是外科手術切除，但術后復發/轉移率高。因此，尋找能夠評估GIST發生、發展和預后的標志物非常重要。

PTEN蛋白具有脂質磷酸酶與蛋白磷酸酶2種活性，脂質磷酸酶活性是PTEN抑制腫瘤的主要功能基礎[9]。人體多種正常組織中均存在PTEN蛋白的表達，但在相應的腫瘤組織中表達降低或缺失。本研究免疫組織化學分析顯示, GIST組織中PTEN陽性表達率較瘤旁正常組織明顯降低，其表達水平與病理性核分裂象、危險度分級、浸潤深度呈負相關。相關研究[10]通過對食管癌的檢測發現，晚期食管癌患者腫瘤組織中PTEN蛋白表達下調并且與病理分期和預后明顯相關。

Akt蛋白激酶通過其介導的磷酸化過程調節下游分子活性，在促進腫瘤細胞增殖、存活和轉移等方面發揮重要作用。研究[11-12]表明，由多種機制導致的Akt失調是眾多人類惡性腫瘤(如胃癌、肺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、乳腺癌和前列腺癌等)發生的特點之一。PI3K/Akt通路也是GIST細胞最關鍵的存活通路之一[4]。本研究免疫組織化學分析顯示, GIST組織中p-Akt陽性表達率顯著高于瘤旁正常組織，表達水平與病理性核分裂象、危險度分級、浸潤深度有關，通過分析p-Akt表達變化，可能對評估GIST惡性程度有所幫助。本研究發現, GIST組織中PTEN蛋白與p-Akt蛋白的表達呈顯著負相關，推測在GIST中, PTEN作為PI3K/Akt信號轉導通路的一個主要負調節分子，可能通過一系列機制抑制Akt的磷酸化，從而起到抑制GIST細胞活化、增殖、侵襲的作用。當然，其具體分子機制還需要進一步研究闡明。

本研究同時觀察到, PTEN在NIH極低危和低危組GIST腫瘤組織中表達水平相仿，而在中危和高危組中的表達水平明顯下降; p-Akt在NIH極低危和低危組GIST腫瘤組織中表達水平相仿，而在中危和高危組中的表達水平顯著升高(P<0.05)。單因素和多因素生存分析也顯示，PTEN陰性表達和p-Akt的陽性表達是影響GIST預后的獨立危險因素。這說明PTEN、p-Akt 蛋白表達水平與GIST 惡性進展及不良預后顯著相關，進一步提示聯合檢測PTEN、p-Akt 蛋白的表達水平有利于評價病情、評估預后及指導治療。由于本研究中ROC曲線分析未顯示PTEN和p-Akt具有顯著的預后預測能力，因此PTEN、p-Akt 蛋白的表達水平對GIST預后的預測能力仍有待進一步大樣本量研究驗證。目前正在臨床試驗中的Akt抑制劑包括capivasertib(AZD5363), MK-2206和ipatasertib(GDC-0068), 臨床數據顯示，在多種PTEN缺陷型腫瘤和異種移植模型中Akt抑制劑敏感性明顯提高[13]。此外，在缺乏PTEN表達的完整或去勢前列腺癌小鼠模型中, capivasertib已顯示出強大的抗腫瘤作用，并提高了由PTEN/p53缺失驅動的侵襲性前列腺癌模型的生存率[14]。但目前關于此類藥物在GIST中的報道較少。未來，開發恢復PTEN正常表達、抑制Akt磷酸化的藥物，抑或是兩類藥物聯合應用可能成為GIST藥物治療探索的方向之一。

綜上所述, GIST組織中PTEN蛋白表達下降，而p-Akt蛋白的表達明顯升高，與患者預后關系密切，可作為臨床評估GIST患者預后的潛在標志物。