miRNA-93對2型糖尿病合并急性心肌梗死患者的早期診斷價值

王 艷, 鄒會玲, 剛 強, 孫 宇

(徐州醫科大學附屬宿遷醫院/南京鼓樓醫院集團宿遷醫院,1. 老年醫學科, 2. 內分泌科, 江蘇 宿遷, 223800)

2型糖尿病(T2DM)是最常見的內分泌代謝疾病，中國T2DM患病率已高達11.6%, 且發病率仍呈持續增高趨勢[1]。T2DM已被證實是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(CHD)的影響因素[2]。急性心肌梗死(AMI)是CHD最危重的類型，患者病死率高，整體預后差。與非糖尿病患者相比, T2DM合并AMI患者的發病年齡較小，癥狀不典型，冠狀動脈病變更加嚴重，預后更差。快速、準確地診斷AMI并予以有效的治療對改善患者預后至關重要[3]。目前，心肌損傷標志物中以心肌肌鈣蛋白(cTn)的敏感性和特異性最高，胸痛發作4～12 h即可在血清中檢測到cTn水平升高，但在AMI發病的早期仍不夠敏感; 同時, cTn在終末期腎功能衰竭、心力衰竭、快速心律失常等疾病患者中亦可升高[4-5]。因此，臨床上迫切需要尋找一種在T2DM合并AMI時變化更早、敏感性和特異性更高的新型生物學標志物[6]。微小核糖核酸(miRNA)是非編碼小分子RNA中的一種，研究[7-8]證實外周血中miRNA不僅存在穩定，而且隨疾病類型改變和持續時間變化出現表達種類和表達量的改變。作者的前期研究[9]發現miRNA-93可以作為糖尿病視網膜病變的早期診斷標志物，表明miRNA-93參與AMI心肌損傷過程，可能在AMI發病早期即發生表達改變。本研究探討miRNA-93在T2DM合并AMI患者中的表達水平，評估其在T2DM合并AMI中的早期診斷價值，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究納入2018年10月—2021年1月因胸痛在徐州醫科大學附屬宿遷醫院心血管內科住院治療的T2DM患者147例，所有患者均在發病6 h內到達醫院，經冠狀動脈造影后明確診斷為AMI, 分為AMI組76例和非AMI組71例(包括穩定型心絞痛、心力衰竭、主動脈夾層、反流性食管炎等)，年齡37～92歲，平均(56.7±11.1)歲。納入標準: ① 年齡≥18歲者; ② 病歷資料數據齊全者; ③ 簽署知情同意書者。排除標準: ① 嚴重的肝腎功能衰竭、惡性腫瘤、嚴重感染、合并自身免疫性疾病者; ② 近期有冠狀動脈溶栓、支架植入或搭橋病史者。本研究獲得徐州醫科大學附屬宿遷醫院倫理委員會審批。

參考中華醫學會相關指南[10-11]的AMI診斷標準, cTn至少1次超過正常參考值上限，同時有急性心肌缺血的臨床證據: ① 急性心肌缺血癥狀; ② 新的缺血性心電圖改變;③ 新發病理性Q波; ④ 新的存活心肌丟失或室壁節段運動異常的影像學證據; ⑤ 冠狀動脈造影或腔內影像學檢查證實冠狀動脈血栓。T2DM的診斷標準參照中國2型糖尿病防治指南: ① 具有典型糖尿病癥狀(口干、多飲、多尿、伴體質量下降)且隨機靜脈血糖≥11.1 mmol/L; ② 空腹血糖(FBG)≥7.0 mmol/L; ③ 口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)結果顯示葡萄糖負荷后2 h血糖≥ 11.1 mmol/L。

1.2 研究方法

采用電化學發光儀(Beckmall Coulter, 美國)檢測所有患者發病6 h內的心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和肌紅蛋白(Mb)水平。采用全自動生化免疫分析儀測定總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平。

1.3 血清miRNA-93檢測

應用實時熒光定量PCR(qPCR)儀(ABI, 美國, 7500)自帶分析軟件檢測所有入組患者發病6 h內血清miRNA-93水平。該qPCR為加尾法，以u6為內參，采用miRNeasy血清血漿純化試劑盒(Qiagen, 德國，應用生物系統)進行小RNA提取，按試劑盒說明書(Qiagen, 德國)提取血漿總核糖核酸300 μL, 根據試劑盒說明書(Qiagen, 德國)合成cDNA。使用Premier Primer 5.0軟件，根據GenBank和miRBase中公布的基因序列設計引物。設置3個復孔，記錄每孔的CT值，以3個復孔的平均值作為最終結果。引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列

1.4 統計學方法

2 結 果

2.1 2組患者基線資料比較

2組男性比率、吸煙史、高血壓史、LDL-C、cTnI、miRNA-93比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組患者臨床資料比較

2.2 MiRNA-93對AMI的早期診斷價值

應用受試者工作特征(ROC)曲線分析miRNA-93、cTnI對AMI的早期診斷價值，結果顯示, miRNA-93預測AMI的曲線下面積(AUC)為0.884，高于cTnI的AUC 0.786, 差異有統計學意義(P<0.05), 提示miRNA-93具有良好的敏感性和特異性。見表3。

表3 MiRNA-93、cTnI對AMI的診斷價值

2.3 AMI發生的危險因素

以是否發生AMI為因變量，以性別、吸煙史、高血壓病史及LDL-C為自變量，結果顯示, miRNA-93和吸煙史分別是AMI發生的獨立危險因素(OR=3.285、1.864,P均<0.05)。見表4。

表4 AMI發生的危險因素的Logistic回歸分析

3 討 論

心血管事件是T2DM患者最重要的終點事件，也是T2DM患者死亡的最常見原因，其中AMI的死亡率最高[12]。合并T2DM的AMI患者或可合并其他多種糖尿病慢性并發癥，其發病早期可能出現癥狀不典型，甚至無痛性AMI, 且cTnI也可能因其他合并癥導致敏感性和特異性下降，對T2DM合并AMI患者的早期精準診斷提出了挑戰，臨床上急需一種在T2DM患者AMI發病時變化更快、敏感性和特異性更高的新型生物學標志物。MiRNA因其獨特的表達方式和代謝特點，已成為多種疾病早期診斷的生物標志物，作者的前期研究[13]發現miRNA-93可以作為糖尿病視網膜病變(DR)的早期診斷標志物，表明miRNA-93參與AMI的發病過程。本研究發現T2DM患者中，合并AMI的患者miRNA-93表達顯著高于非AMI患者; ROC曲線顯示，與cTnI相比, miRNA-93對T2DM合并AMI患者具有良好的早期診斷價值; 多因素Logistic回歸分析顯示, miRNA-93是T2DM發生AMI的獨立危險因素。

近年來研究[14]發現, miRNA參與了生物體內復雜的生理過程，并與多種人類疾病如糖尿病、心血管疾病和癌癥等密切相關。MiRNA是非編碼小分子RNA 中的一種，其長度約為22個核苷酸，通過促進靶基因的降解或者抑制翻譯，在轉錄后水平對基因的表達進行調控。研究[15]已經證實，外周血中miRNA不但可以穩定存在，而且隨疾病類型和持續時間而出現表達種類和表達量的改變; 同時, miRNA還表現出了極強的穩定性和抗降解能力，在多種疾病的早期診斷中展示出良好的潛力。AMI為CHD最危重的類型，若同時合并T2DM則死亡率明顯升高，且由于臨床表現的不典型，目前的診斷方法存在一定的局限性。目前，外周血miRNA在T2DM中的作用已有報道，另有研究者提出外周血miRNA可以作為CHD的診斷標志物，但研究結果并不一致，這可能是由于miRNA在不同類型CHD, 甚至發病不同時期的表達也不一致，例如穩定型和不穩定型心絞痛患者的miRNA表達譜就具有顯著差異[16-17]。在T2DM合并AMI的早期診斷方面，尚無相關報道。

本課題組長期聚焦于miRNA對T2DM慢性并發癥的早期診斷價值，前期研究發現miRNA-93可作為糖尿病性視網膜病變(DR)的早期診斷生物標志物。在人群研究中, ZHONG Z等[18]發現miRNA-93在AMI患者中表達同樣呈上調表現，提示miRNA-93可能參與AMI發病; 在基礎研究方面, LIU J W等[19]明確了miRNA-93參與了心肌損傷過程。SOHRABIFAR N等[20]進一步區分了冠心病患者中是否合并T2DM, 發現在冠心病合并T2DM患者中, miRNA-93的表達升高，提示miRNA-93可能共同參與了T2DM和冠心病的重要病理生理過程。本研究發現，與非AMI患者相比, AMI患者中血清miRNA-93水平明顯升高，與cTn相比, miRNA-93對T2DM合并AMI患者具有更好的早期診斷價值。本研究進一步對發生AMI的危險因素行Logistic回歸分析，發現miRNA-93是AMI發生的獨立危險因素，提示miRNA-93可能促進了T2DM合并AMI患者重要的病理生理過程。

本研究尚存在一定的局限性: ① 本項目為病例對照研究，有可能導致納入人群的選擇存在偏倚; ② 由于受研究時間限制，本研究納入的樣本量較小，可能導致miRNA-93對T2DM合并AMI患者的早期診斷價值產生一定的差異，后續將擴大樣本量并進行前瞻性的隊列試驗來進一步驗證本研究結論。

綜上所述，本研究發現在T2DM合并AMI患者中, miRNA-93可作為一個良好的早期診斷生物標志物，能夠識別一些早期臨床表現不典型患者，避免臨床漏診而導致不良后果。