辛伐他汀對慢性阻塞性肺疾病大鼠的抗炎作用及其機制研究

劉 青, 孫伯堅, 任冬飛, 李 林, 楊智暉, 梁瑞凱

(1. 河北省第八人民醫院 呼吸內科, 河北 石家莊, 050021;2. 河北醫科大學第一醫院 風濕免疫科, 河北 石家莊, 050000)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種慢性氣道疾病，不完全可逆的氣流受限是其主要特征，可以導致患者慢性活動能力降低，甚至發展為永久性的不可逆損害，病死率高[1-2]。目前，研究[3-5]一致認為，氣道慢性非特異性炎癥是導致COPD發生發展的病理基礎，炎性細胞及其細胞因子在發病期間起到了關鍵作用，這些因子包括基質金屬蛋白酶家族成員、白細胞介素(IL)家族成員與腫瘤壞死細胞因子(TNF)家族成員等。《慢性阻塞性肺疾病全球防治創議》[6]在研究疾病治療的方向中明確指出，控制COPD患者癥狀，抑制病情進一步發展是治療的關鍵，但至今對于COPD仍無特效防治藥物。他汀類藥物主要用于治療心血管疾病，調脂、預防動脈粥樣硬化是目前臨床對該藥療效的普遍認識，但近幾年流行病學研究發現，他汀類藥物能夠縮短急性加重期COPD患者的住院時間，并降低病死率，可能的機制包括影響炎癥介質和細胞黏附因子的釋放、抗氧化作用、加速凋亡細胞清除等[7-9]。但目前關于他汀類藥物治療COPD價值的研究較少，具體作用機制尚不可知。本研究觀察辛伐他汀用于COPD大鼠治療的價值，探討藥物對疾病可能的抗炎機制，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物

選擇雄性SD大鼠50只，均購自河北醫科大學動物管理中心，大鼠均為清潔級，周齡為6～8周，平均(7.0±1.0)周; 體質量0.18～0.22 kg, 平均(0.20±0.02)kg。

1.2 主要藥品、試劑

辛伐他汀購自北大醫藥股份有限公司(國藥準字H20093359), 劑量20 mg/片; 10%水合氯醛購自青島宇龍海藻有限公司; 脂多糖(LPS)由美國Sigma公司提供; 香煙由滁州煙卷廠生產，尼古丁1.2 mg, 焦油量19 mg; 炎性因子試劑盒由深圳達科為生物技術有限公司提供。

1.3 主要儀器設備

RSE3020型動物肺功能儀器、AniRes2005軟件分析系統由北京貝蘭博科技有限公司提供, JW-3021HR型高速臺式離心機由安徽嘉文儀器裝備提供，顯微鏡由日本OLYMPUS公司提供。

1.4 建模和分組方法

① 分組: 50只雄性SD大鼠進行適應性飼養7 d后，隨機選擇10只大鼠作為空白對照組，將剩下的40只大鼠建立COPD模型，建模成功后隨機分為模型組、辛伐他汀組，其中辛伐他汀組根據劑量的不同，又分為低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10只。② COPD大鼠模型建立[10]: 正確建立COPD大鼠模型。空白對照組給予1 mL/(100 g·d)的生理鹽水灌胃，其他40只COPD模型大鼠同樣給予等劑量生理鹽水灌胃8周，灌胃第5周開始行COPD造模。辛伐他汀各組大鼠給予辛伐他汀(低劑量組: 5 mg/kg, 中劑量組: 10 mg/kg, 高劑量組: 15 mg/kg)灌胃, 1次/d, 灌胃時間仍為8周。全部大鼠除煙熏時間外，其他時間均在相同環境下飼養。建模成功后觀察4周, 4周后處死大鼠。本研究中全部大鼠的處理均符合《醫學實驗課中實驗動物倫理學要求的實施與思考》[11]中相關意見和規定。

1.5 觀察指標

肺功能檢測: 造模4周后，麻醉全部大鼠并將其固定，切開頸部皮膚，分離組織或暴露氣管，將三通管氣管插管插入，局部縫合固定，將氣管插管一端連接動物呼吸機，檢測最大肺活量(FVC)、第0.1秒用力呼氣容積(FEV0.1)、最大呼氣流速(PEF)。

檢測支氣管肺泡灌洗液中炎性因子水平。① 支氣管肺泡灌洗液采集方法: 將肺功能檢測結束但依然處于麻醉狀態的大鼠胸腔打開，使用血管鉗將左支氣管結扎。經氣管插管將3 mL生理鹽水注入右肺, 20 s后回抽收集支氣管肺泡灌洗液，反復進行3次，最終獲取支氣管肺泡灌洗液6 mL。將采集得到的支氣管肺泡灌洗液經1 500 轉/min離心15 min, 取上清液保存待檢。② 檢測方法: 白細胞介素-8(IL-8)、白細胞介素-17(IL-17)、白細胞介素-32(IL-32)、腫瘤壞死細胞因子-α(TNF-α)等炎性因子水平均采用酶聯免疫吸附法檢測，嚴格按照說明書進行操作。

逆轉錄: 采用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測維甲酸相關孤兒受體(ROR-γt)mRNA表達量，使用TRIzol實際提取RNA, 逆轉錄互補脫氧核糖核酸，做聚合酶鏈反應(PCR)擴增。確定目的基因引物序列。使用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳比較ROR-γt與對照組相對吸光度值，行半定量分析，計算相對表達量。

1.6 統計學分析

2 結 果

2.1 5組大鼠肺功能檢查結果比較

與空白對照組比較, COPD模型大鼠肺功能指標水平均下降，差異有統計學意義(P<0.05); 高劑量組大鼠肺功能下降程度低于模型組、低劑量組、中劑量組，差異有統計學意義(P<0.05); 低劑量組與中劑量組各肺功能指標水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 5組大鼠肺功能檢查結果比較

2.2 5組大鼠支氣管肺泡灌洗液中性因子水平比較

與空白對照組比較, COPD模型大鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-8、IL-17、IL-32、TNF-α含量增加，差異有統計學意義(P<0.05); 高劑量組大鼠各支氣管肺泡灌洗液中炎性因子含量低于模型組、低劑量組、中劑量組，差異有統計學意義(P<0.05); 低劑量組與中劑量組支氣管肺泡灌洗液中炎性因子水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 5組大鼠支氣管肺泡灌洗液炎性因子水平比較 ng/L

2.3 5組大鼠ROR-γt mRNA表達量比較

與空白對照組比較, COPD模型大鼠ROR-γt mRNA相對表達量增加，差異有統計學意義(P<0.05); 高劑量組大鼠ROR-γt mRNA相對表達量低于模型組、低劑量組、中劑量組，差異有統計學意義(P<0.05); 低劑量組與中劑量組ROR-γt mRNA相對表達量比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 5組大鼠ROR-γt mRNA表達量比較

3 討 論

COPD是一種以肺實質、氣流受限、全身炎癥為主要特征的慢性疾病，被認為是炎癥反應的失調狀態，以氣道炎癥、肺部炎癥及系統性多器官損害為主要表現[12]。COPD患者無論是氣道炎癥還是全身炎癥反應，其發生機制均較復雜，炎癥反應過程都有大量細胞因子、趨化因子及其他介質參與[13], 可見疾病治療期間抑炎、抗炎具有重要意義。

臨床多認為，吸煙是COPD的獨立危險因素，長時間、大量吸煙會導致肺泡巨噬細胞、支氣管上皮細胞及其他主要炎癥細胞活化，釋放出大量細胞因子及趨化因子，包括IL-6、IL-8、IL-17、IL-32、TNF-α等，這些主要的炎癥因子在COPD炎癥反應發生、發展期間具有重要作用[14-15]。研究[16]發現，穩定期COPD患者痰液內IL-18、TNF-α等炎癥因子水平升高，隨著疾病進展至急性加重期，患者上述各炎癥因子水平顯著升高，且高于穩定期。IL-8、IL-17、IL-32、TNF-α均是重要的促炎細胞因子，其中IL-8通過肺泡巨噬細胞、中性粒細胞、上皮細胞等釋放，是主要的中性粒細胞趨化因子，在COPD患者肺內呈高表達，可以對中性粒細胞誘導的炎癥反應產生激活作用[17]。IL-17主要來源于CD4+T淋巴細胞因子的Th17細胞，經特異性轉錄因子ROR-γt編碼產生效應因子，該因子的生物活性廣泛，不僅能夠招募巨噬細胞與中性粒細胞，還能促基質金屬蛋白-9產生。此外, IL-17還對支氣管上皮細胞中氣道黏液黏蛋白的產生有影響，參與慢性炎癥反應的進程[18-19]。IL-32主要通過T細胞、上皮細胞等合成分泌，是一種編碼炎癥性細胞因子，可經激活各主要磷酸化途徑來誘導其他細胞因子及趨化因子的產生，參加炎癥反應的發生過程。此外, IL-32還能誘導單核細胞轉化為巨噬細胞，增強多形核粒細胞的殺傷力與吞噬功能，參與COPD特異性免疫應答與炎癥反應，進一步推動COPD病情的進展[20]。TNF-α是早期炎癥引發因子，能夠激活內皮細胞，直接刺激黏附因子的相對表達，誘導中性粒細胞遷移，并釋放IL-8, 白細胞趨化作用極強。同時, TNF-α還能促進中性粒細胞功能的增強，促中性粒細胞脫顆粒，合成并分泌出更多的TNF-α, 進一步加重炎癥程度，加快COPD病情進展[21]。本研究結果顯示, COPD模型大鼠肺功能較空白對照組降低，各炎癥因子水平較空白對照組升高，且ROR-γt mRNA相對表達量也升高，與王戈[22]研究結果一致，說明炎癥反應貫穿了COPD疾病發生、發展的過程。因此早期給予COPD患者合理的抗炎藥物治療，幫助患者減輕全身炎癥反應，可能對增強療效有一定價值。

他汀類藥物作為一類3-羥-3-甲基-戊二酰輔酶還原酶抑制劑，被廣泛用于心血管疾病并發癥的預防及膽固醇降低的治療。研究[23]發現，他汀類藥物不僅具有理想的調脂作用，還具有強大的“外周效應”，如抗炎癥介質、抗炎癥細胞因子、抗氧化、抑制黏附分子表達、免疫調節等。他汀類藥物具有的這些“外周效能”可能是降低COPD患者病死率與住院率的基礎，但藥物治療COPD有效性與安全性及相關機制的研究國內并不多見。為進一步觀察他汀類藥物治療COPD是否能獲得理想效果，本研究成功建立了COPD大鼠模型，結果顯示，辛伐他汀治療的大鼠肺功能優于模型組，各主要促炎因子水平和ROR-γt mRNA相對表達量低于模型組，高劑量辛伐他汀的應用帶來的改善效果最為理想，而低劑量與中劑量比較，差異無統計學意義(P>0.05), 提示辛伐他汀用于COPD的治療可能有一定抗炎效果。辛伐他汀除有降脂作用外，還具有潛在的多效性，包括抗炎、改善血管內皮功能等作用，使用藥物后可通過抑制甲羥戊酸途徑中止Rho的活化，從而抑制并減少類異戊二烯化產物的合成，最終減少諸多前炎癥細胞因子的合成與釋放，如IL-6、IL-8、TNF-α等[24]。王燕等[25]研究發現，辛伐他汀能夠減輕COPD大鼠肺部炎癥介質的釋放，減輕氣道炎癥與肺氣腫程度，阻止大鼠氣道內阻力進一步增加，與本研究辛伐他汀的抗炎效果一致，進一步說明辛伐他汀在COPD中的應用價值。既往相關研究[26-27]發現，阿托伐他汀對炎癥的調節作用主要通過Toll樣受體、炎性體、小G蛋白、mircoRNA小分子非編碼單鏈RNA、過氧化體增殖物激活型受體等途徑實現，其中Toll樣受體已被證實在阿托伐他汀調控炎癥反應過程中扮演重要角色，這類受體主要經髓樣分化因子88信號通路激活核因子κB, 從而啟動炎性因子的釋放，而阿托伐他汀在使用后可以抑制Toll樣受體的表達，抑制這些相關受體的敏感性，并通過抑制外周血單個核細胞Toll樣受體的表達減少炎性因子的分泌，促進相關蛋白表達的下調，從而發揮抗炎作用。但值得注意的是，目前關于阿托伐他汀的抗炎機制仍處于研究階段，且相關研究較少，尚無較多循證學依據作為支持，故本研究所得的結果真實、可靠，均需要在未來開展前瞻性、大樣本的研究加以驗證。

綜上所述，辛伐他汀能夠通過抑制COPD大鼠肺組織ROR-γt的表達，從而抑制大鼠肺部炎癥進一步發展，降低各炎癥因子的表達，促進肺功能改善。