血清LncRNA MEG3、SNHG5水平與慢性阻塞性肺疾病全球倡議分級及預后的相關性分析

石 赟, 陳艷蓉, 張 凈, 羅 佳

(首都醫科大學附屬北京友誼醫院 老年醫學科, 北京, 100050)

長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一種轉錄長度>200 bp, 但無蛋白編碼功能的核苷酸序列。大量研究[1-3]證實, LncRNA與細胞增殖、凋亡、侵襲等生理過程密切相關。慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以不完全氣流受限為特征的進展性疾病，有效評估COPD急性加重期(AECOPD)患者病情并預測其預后在AECOPD治療中具有重要意義[4-6]。徐建光等[7]研究發現, COPD患者外周血單個核細胞中長鏈非編碼RNA小核仁RNA宿主基因3 (LncRNA SNHG3)表達水平下降，且推測LncRNA SNHG3表達量降低可能是COPD發病的重要原因。由此推測, LncRNA水平的改變可能與COPD患者病情及預后存在一定關系。本研究將長鏈非編碼RNA母系表達基因3(LncRNA MEG3)及小核仁RNA宿主基因5(SNHG5)納為研究指標，通過檢測87例AECOPD患者血清LncRNA MEG3、SNHG5水平分析其在判斷患者病情及預后中的應用價值，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將2017年6月—2020年6月收治的87例AECOPD患者納為急性組，將急性組中經治療1個月后病情恢復穩定的46例患者納為穩定組，同期50例健康志愿者納為對照組。① 急性組入選標準: 患者符合《慢性阻塞性肺病全球倡議慢性阻塞性肺病指南(2013更新版)》[8]中相關診斷標準，具有呼吸困難、慢性咳嗽咳痰癥狀，持續性氣流受限，短期內咳嗽、喘息、咳痰等癥狀加重，需改變治療方案。② 穩定組入選標準: 上述AECOPD患者經治療后病情基本恢復至急性加重前狀態，病情穩定1個月以上。③ 健康志愿者入選標準: 健康志愿者無COPD病史，無慢性咳嗽、咳痰、喘息等病史。排除標準: 入院前2周內使用糖皮質激素或抗菌藥物治療者、合并其他部位感染者、合并惡性腫瘤者、合并嚴重免疫缺陷性疾病者和認知障礙者。急性組男71例，女16例; 年齡59～88歲，平均(72.56±12.62)歲; 合并高血壓者22例，合并糖尿病者13例。穩定組男36例，女10例; 年齡56～85歲，平均(71.58±13.57)歲; 合并高血壓者10例，合并糖尿病者7例。健康對照組男40例，女10例; 年齡58～87歲，平均(70.58±15.36)歲; 合并高血壓者9例，合并糖尿病者6例。

1.2 血液樣本采集

分別在COPD患者急性加重期及穩定期采集外周靜脈血，對照組采用體檢廢棄血清。采用促凝管采集被研究者靜脈血5 mL, 室溫下靜置30 min, 1 500轉/min離心10 min, 收集上層液體置于EP管內, -80 ℃冰箱中保存待用。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)檢測血清LncRNA表達

采用TRIzol提取血清中總RNA, 利用Thermofisher公司生產的NanoDrop ND1000分光光度計檢測RNA濃度與純度。總RNA進行反轉錄處理得到cDNA。RT-qPCR法檢測血清SNHG5與內參基因磷酸脫氫酶(GAPHD)的表達，反應體系為: Mix 10 μL, 上下游引物各1 μL, cDNA 2 μL, 焦碳酸二乙酯(DEPC)水6 μL。PCR擴增條件: 第1階段95 ℃,5 min, 第2階段95 ℃, 30 s, 持續35個循環，每組樣品重復3次。基因相對表達量采用2-△△α法計算。引物序列見下: GAPHD正向引物為5′-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3′; GAPHD反向引物為5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′; MEG3正向引物為5′-CTGCCCATCTACACCTCACG-3′; MEG3反向引物為5′-CTCTCCGCCGTCTGCGCTAGGGGCT-3′; SNHG5正向引物為5′-TACTGGCTGCGCACTTCG-3′; SNHG5反向引物為5′-CAGTAAAAGGGGAACACCA-3′。

1.4 COPD患者病情及預后相關指標檢測

① 檢查患者病情相關指標: 收集患者一般資料，包括吸煙史、COPD病程、住院時間、白細胞(WBC)計數、用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼氣容積(FEV1), 計算第1秒用力呼氣容積與用力肺活量的比值(FEV1/FVC)、第1秒用力呼氣容積占預計值百分比(FEV1%預計值)。② GOLD分級參考《慢性阻塞性肺病全球倡議慢性阻塞性肺病指南(2013更新版)》標準[8], 共分為4級，分級越高說明患者病情越嚴重。COPD多維分級評分系統 (BODE)指數包含體質量指數、氣流阻塞程度、呼吸困難程度及運動能力等指標，得分與病情嚴重程度呈正相關。③ AECOPD患者預后評估: 將住院期間死亡的AECOPD患者納為預后不良組。

1.5 統計學方法

2 結 果

2.1 3組臨床資料比較

急性組、穩定組及對照組男女占比、年齡、FEV1%預計值水平比較，差異無統計學意義(P>0.05); 3組吸煙史、WBC及FEV1/FVC水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。急性組住院時間長于穩定組，差異有統計學意義(P<0.05); 急性組和穩定組COPD病程比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組臨床資料比較

2.2 3組血清LncRNA MEG3、SNHG5水平比較

急性組及穩定組血清LncRNA MEG3、SNHG5水平均低于對照組，且急性組血清LncRNA MEG3、SNHG5水平低于穩定組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組血清LncRNA MEG3、SNHG5水平比較

2.3 急性組及穩定組GOLD分級及BODE指數得分比較

急性組GOLD分級與穩定組比較，差異有統計學意義(P<0.05); 急性組BODE指數得分高于穩定組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 急性組及穩定組GOLD分級及BODE指數得分比較

2.4 血清LncRNA MEG3、SNHG5水平與COPD患者不良預后的關系分析

87例AECOPD患者住院期間共死亡18例，被納入預后不良組，其余69例被納入預后良好組。預后不良組血清LncRNA MEG3、SNHG5水平低于預后良好組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 血清LncRNA MEG3、SNHG5水平與COPD患者不良預后的關系分析

2.5 血清LncRNA MEG3、SNHG5水平與COPD患者其他指標間的相關性分析

相關性分析提示, COPD患者血清LncRNA MEG3與吸煙史、GOLD分級、BODE指數得分呈負相關(P<0.05), 與FEV1/FVC水平呈正相關(P<0.05)。LncRNA SNHG5水平與吸煙史、住院時間、GOLD分級及BODE指數得分呈負相關(P<0.05), 與FEV1/FVC呈正相關(P<0.05)。見表5。

表5 血清LncRNA MEG3、SNHG5水平與其他指標的相關性分析

3 討 論

COPD是全球患者死亡的主要病因，但關于COPD的致病機制目前尚不清楚。研究認為, COPD與炎癥反應、氧化應激、自噬、細胞凋亡等相關。隨著全球分子研究的不斷進展, LncRNA被證實是一種與細胞增殖、凋亡等生理過程密切相關的物質，成為了目前研究[9-10]的焦點。

本文通過查閱文獻發現, MEG3、SNHG5 2種LncRNA與肺部病變有關。鄭志剛等[11]研究發現，肺癌組織中LncRNA MEG3表達低于癌旁組織，且其表達量影響患者生存時間，可作為肺癌預后判斷的潛在分子標志物。薛明強等[12]通過體外實驗發現, LncRNA MEG3能調節肺癌H1299細胞對放射的敏感性。陳剛等[13]研究發現，血清LncRNA SNHG5水平在診斷非小細胞肺癌(NSCLC)中具有良好的靈敏性及特異性。以上研究證實, LncRNA MEG3及SNHG5可能參與肺癌的發生及發展，推測2種指標可能與COPD也存在一定的關聯性。

本研究比較3組血清LncRNA MEG3、SNHG5水平發現，急性組、穩定組血清LncRNA MEG3、SNHG5水平均低于對照組，且急性組患者血清LncRNA MEG3、SNHG5水平低于穩定組患者，提示LncRNA MEG3、SNHG5可能參與AECOPD的發生過程。相關性分析發現，血清LncRNA MEG3、SNHG5水平與COPD患者GOLD分級及BODE指數得分均呈負相關，與FEV1/FVC呈正相關，提示血清LncRNA MEG3、SNHG5在反映患者病情嚴重程度中也具有良好的應用價值。

研究[14-15]表示，煙草中有害物質會損傷氣道上皮細胞與纖毛運動，降低氣道凈化能力，并促進支氣管黏液腺與杯狀細胞增生肥大，分泌更多黏液，同時刺激副交感神經，促進平滑肌收縮。此外，尼古丁等有害物質還能促使自由基的生成，誘導中心粒細胞釋放蛋白酶，破壞肺纖維彈力，誘導肺部病變。本研究發現，COPD患者血清LncRNA MEG3、SNHG5水平與患者吸煙史密切相關，推測LncRNA MEG3、SNHG5可能參與了COPD的進展。

本研究87例AECOPD患者中共18例住院期間死亡，將其納入預后不良組。預后不良組與預后良好組治療前血清LncRNA MEG3、SNHG5水平比較結果發現，預后不良組血清LncRNA MEG3、SNHG5水平低于預后良好組，提示血清LncRNA MEG3、SNHG5在反映COPD患者預后中也具有一定的臨床應用價值。

綜上所述, COPD患者血清LncRNA MEG3、SNHG5水平較健康者下降，且與患者肺功能及病情嚴重程度有關，在判斷AECOPD患者短期內再次急性復發中也具有一定價值。