鈉-葡萄糖共轉運蛋白-2抑制劑對2型糖尿病大鼠心功能的保護作用及其機制研究

冷燕，張愛寧，張麗瓊，吳洋，李維，熊永紅，李文遠，季燁龍，夏中元

1.武漢大學人民醫院麻醉科，湖北 武漢 430060；2.華中科技大學同濟醫學院附屬武漢兒童醫院(武漢市婦幼保健院)手術室，湖北 武漢 430016

2 型糖尿病是心血管疾病的獨立危險因素，糖尿病心肌中多種細胞機制的失調增加了心衰的風險，包括異常的自噬、氧化應激失衡和晚期糖基化產物的積累等[1]。多種針對失調的細胞機制和病理生理途徑的藥物干預可降低心衰的風險，但優化的血糖控制與2型糖尿病患者心血管功能改善的關系最為密切[2]。鈉-葡萄糖共轉運蛋白-2(glucose transporters 2，SGLT2)位于腎臟近端小管的S1～2 段，能重吸收約90%的葡萄糖，而SGLT2 抑制劑(SGLT-2i)通過抑制腎臟近端小管對鈉和葡萄糖的重吸收而降低血糖[3]。近年來SGLT-2i的心血管系統保護作用成為新的研究熱點。一項針對亞太、中東和北美2 型糖尿病患者的大型臨床研究發現，啟動SGLT-2i 治療與較低的心血管事件風險相關[4]。研究推測，SGLT2抑制劑可能通過促排鈉、降血壓、胰島素增敏等途徑發揮心血管保護作用，但其確切機制目前仍未明確[3]。糖尿病引起的心臟功能異常伴隨著自噬的損害，研究證實雷帕霉素能夠通過抑制其靶蛋白增加自噬緩解糖尿病心肌病、改善心功能[5]。然而2 型糖尿病代謝組學提示，SGLT2i 可改善腎臟功能，可能與提高腎小管自噬水平相關[6]。SGLT2i 是否可通過誘導保護性自噬從而改善糖尿病大鼠心功能尚待進一步研究。本研究擬探討SGLT2i 對2 型糖尿病大鼠心功能和自噬水平的影響及其機制，為2 型糖尿病心血管并發癥的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動物選擇及分組 選取成年雄性大鼠40只，體質量220～230 g，由北京華阜康生物公司提供。實驗動物適應性飼養1周后，采用隨機數表法將大鼠分為對照組(Ctrl 組)、糖尿病組(Dia 組)、糖尿病+達格列凈組(Dia+Dap組)和糖尿病組+達格列凈+自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤組(Dia+Dap+3-MA 組)，每組8 只。2 型糖尿病大鼠造模成功后，繼續高脂高糖飼料飼養4周，Dia+Dap 組每日灌胃給予達格列凈[0.1 mg/(kg·d)]，Dia+Dap+3-MA組大鼠尾靜脈注射3-MA[15mg/(kg·周)]。非藥物灌胃或尾靜脈注射的大鼠，灌胃或尾靜脈注射同等體積的生理鹽水。本研究通過實驗動物福利倫理審查。

1.2 2型糖尿病大鼠模型的制備 大鼠適應性飼養1 周后，高脂高糖飼料喂養4 周。禁食12 h 后腹腔注射檸檬酸鹽-鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma公司，美國)30 mg/kg，對照組給予等劑量檸檬酸鹽緩沖液進行尾靜脈注射。3 d 后尾靜脈采血，空腹血糖≥11.1 mmol/L，并出現多飲、多食、多尿的典型糖尿病癥狀，則認為2型糖尿病大鼠模型制備成功，剔除不成模大鼠。繼續高脂高糖飼料喂養4 周，所有糖尿病大鼠自由飲水及進食，各組大鼠均飼養在溫度和濕度恒定的SPF級動物中心。

1.3 大鼠空腹血糖濃度和胰島素抵抗水平 檢測大鼠腹腔注射STZ后48 h，禁食12 h取尾靜脈血，血糖儀檢測空腹血糖濃度(fasting blood glucose，FBG)，采用酶聯免疫法(ELISA)檢測各組大鼠血清胰島素(insulin，INS)水平，穩態模式評估法計算胰島素抵抗指數(HOME-IR)，計算公式如下：HOMA-IR=INS(IU/L)×FBG(mmol/L)/22.5。

1.4 心功能指標測定 2型糖尿病大鼠造模成功4周后，大鼠面罩吸入異氟烷(2%～4%)誘導麻醉。固定大鼠于左側臥位，接心電監護，采用頻率為15 MHz的超聲探頭和GE Vixid7型超聲(ATL公司，美國)檢測大鼠心功能。將探頭置于大鼠胸骨的左緣，與正中線成30°角，顯示大鼠胸骨左室長軸切面。探頭順時針旋轉90°，調整顯示大鼠左室的短軸切面。測量大鼠左室舒張末期容積(LVEDV)、左室收縮末期容積(LVESV)。M型檢測左室射血分數(LVEF)。根據二尖瓣口流速頻譜，測量舒張早期心室充盈速度最大值(E)、舒張晚期心室充盈速度最大值(A)，計算峰值流速比值(E/A比值)。

1.5 Western blot 法測定心肌組織LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、p62 和Becline 1 的表達水平 心功能測定結束后，立即處死大鼠，取新鮮心肌組織，加入預冷的RIPA液裂解心肌組織充分勻漿，低溫離心15 min(2 000 r/min，離心半徑8.6 cm)取上清。Bicinchoninic acid(BCA)法測蛋白濃度，調整蛋白濃度后加入5×SDS 上樣緩沖液，100℃加熱5 min。采用SDS-PAGE 電泳分離和轉膜后，加入p62、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Becline 1和GAPDH一抗4℃搖床孵育12 h (1：1 000，CST 公司，美國)，GAPDH為內參。TBST一抗洗脫后，室溫下熒光二抗避光孵育1 h(1：10 000，Millpore 公司，美國)，紅外成像系統(Li-Cor 公司，美國)成像，Odessay 軟件測量各條帶灰度值(Li-Cor公司，美國)，計算LC3Ⅱ/Ⅰ灰度值比值，p62 和Becline 1 的蛋白表達水平采用目的蛋白灰度值/內參GAPDH的比值表示。

1.6 統計學方法 應用SPSS22.0 軟件進行數據統計學分析，計量資料以均值±標準差()表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠的FBG、INS 和HOMA-IR 指數比較 飼養過程中，觀察發現，對照組大鼠毛發光澤，反應靈敏，而糖尿病組大鼠出現了典型的多飲、多食和多尿的癥狀，同時毛發干枯發黃，活動減少。與Ctrl組注射前比較，高脂高糖飼養四周后，大鼠空腹血糖、血清胰島素水平和胰島素抵抗指數升高，差異有統計學意義(P<0.05)。高脂高糖飼養組腹腔注射STZ 后1周，大鼠空腹血糖水平和胰島素抵抗指數較注射前顯著增高，而血清胰島素水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。Ctrl組腹腔注射生理鹽水后1周，大鼠空腹血糖、血清胰島素水平和胰島素抵抗指數較注射前變化差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血清中FBG和INS水平及HOMA-IR指數比較()

表1 各組大鼠血清中FBG和INS水平及HOMA-IR指數比較()

2.2 各組大鼠的心功能各項指標比較 經胸心臟超聲結果顯示，與Ctrl 組比較，Dia 組LVEDV、LVEF、HR、E峰流速和E/A比值降低，A峰流速升高，差異有統計學意義(P<0.05)，LVESV 差異無統計學意義(P>0.05)。與Dia組比較，Dia+Dap組LVEDV、LVEF、HR、E峰流速和E/A比值升高，A峰流速降低，差異有統計學意義(P<0.05)，LVESV差異無統計學意義(P>0.05)。與Dia+Dap組比較，合并給予自噬抑制劑3-MA的糖尿病大鼠中，LVEDV、LVEF、HR和E/A比值降低，A峰流速升高，差異有統計學意義(P<0.05)，E 峰流速和LVESV差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1和表2。

圖1 各組大鼠心臟超聲圖

表2 各組大鼠的心功能各指標比較()

表2 各組大鼠的心功能各指標比較()

2.3 各組大鼠的心功能及自噬相關蛋白表達水平比較 免疫印跡結果顯示，與Ctrl 組比較，Dia 組LC3Ⅱ/Ⅰ比值降低，Becline1 表達降低，而p62 的表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與Dia 組比較，Dia+Dap 組LC3Ⅱ/Ⅰ比值升高，Becline1 表達升高，而p62 的表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與Dia+Dap 組比較，合并給予自噬抑制劑3-MA 的糖尿病大鼠中，LC3Ⅱ/Ⅰ比值降低，Becline1表達降低，而p62的表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2和表3。

圖2 各組大鼠心臟組織蛋白表達水平

表3 各組大鼠LC3Ⅱ/Ⅰ和p62的蛋白表達水平比較()

表3 各組大鼠LC3Ⅱ/Ⅰ和p62的蛋白表達水平比較()

注：與Ctrl組比較，aP<0.05；與Dia組比較，bP<0.05；與Dia+Dap組比較，cP<0.05。

3 討論

本研究參照文獻[7]，采用高糖高脂飼養4 周后，腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素的方法制備2型糖尿病大鼠模型。STZ 腹腔注射一周后，糖尿病大鼠空腹胰島素水平顯著降低而胰島素抵抗指數顯著增高，提示大鼠的胰島素敏感性降低，2 型糖尿病大鼠造模成功。同其他研究報道一致，飼養8周后，心臟超聲結果顯示糖尿病組大鼠左心室射血分數和E/A峰流速比值較對照組顯著降低，這表明2 型糖尿病大鼠已出現典型的糖尿病心臟收縮和舒張功能不全[8-9]。急性心血管事件是2型糖尿病患者的主要死因[10]，因此探尋2型糖尿病心血管保護措施是相關學科的研究重點。近年來2型糖尿病的藥物研究重心逐漸從傳統致病機制的研究轉移到新的治療靶點和發病機制的研究。鈉-葡萄糖轉運蛋白2 位于腎近曲小管，抑制其功能可減少葡萄糖的重吸收，增加尿糖排泄，從而發揮降糖作用[11]。鈉-葡萄糖共轉運蛋白2 抑制劑是一類新型的口服降糖藥物，美國糖尿病學會和歐洲糖尿病學會(ADA/EASD)指南推薦SGLT2i 可單獨或與其他降糖藥物聯合用于2型糖尿病患者的治療[12]。針對多項大型隨機化臨床試驗的系統評價結果表明，SGLT2i降低了糖尿病患者23%的心血管相關死亡或因心力衰竭住院的風險，合并或不合并動脈粥樣硬化性心血管疾病和心力衰竭史的糖尿病患者也能從SGLT2i治療中獲益[13]。達格列凈是臨床常用的SGLT2i，本研究通過建立穩定的2型糖尿病大鼠心臟損傷模型，證實給予臨床劑量的達格列凈提高糖尿病大鼠左心室LVEF 和E/A 比值，這一結果明確了SGLT2i 對2 型糖尿病大鼠心臟舒張和收縮功能的改善作用。

新近研究發現，SGLT2i能夠減輕糖尿病大鼠的心臟纖維化程度，改善血流動力學，同時能夠有效地降低心肌缺血再灌注后的梗死面積，這一保護作用可能與SGLT2i維持線粒體池的穩定性相關，但具體機制尚待進一步研究證實[14-15]。自噬是細胞代謝過程中保守且必要的機制，基礎水平的自噬對于保護心肌細胞免受持續性高血糖的損傷至關重要，然而糖尿病心肌自噬水平顯著降低，研究證實提高自噬水平有助于延緩糖尿病心肌病的發生發展[16]。值得注意的是，本研究中SGLT2i 改善糖尿病大鼠心臟舒張和收縮功能的同時，伴隨著自噬關鍵蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ比值的升高。為了進一步證實SGLT2i 是否通過激活自噬改善糖尿病大鼠心功能，在給予達格列凈糖尿病大鼠中合并給予自噬抑制劑3-MA，結果顯示，在靜脈給予3-MA的大鼠中，SGLT2i 的心臟保護作用消失，同時3-MA 組中的心肌自噬水平較達格列凈組顯著降低。

綜上所述，SGLT2i 可改善糖尿病大鼠心臟功能，其機制與提高糖尿病大鼠心肌的自噬水平相關。