纖維蛋白原B β鏈-1689、HinfⅠ基因多態(tài)性位點(diǎn)單倍體型與胃癌的關(guān)聯(lián)性分析*

嚴(yán)芝強(qiáng)， 成興真， 王楊， 聶微， 楊芳**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 胃腸外科， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院 臨床血液教研室， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

胃癌(Gastric cancer，GC)是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，最新癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，GC在全球發(fā)病率居第五位、死亡率居第四位[1]。GC的發(fā)病機(jī)制仍不清楚,其發(fā)病涉及遺傳、環(huán)境等多種因素，認(rèn)為在細(xì)胞癌變過(guò)程中起關(guān)鍵作用的是遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)變化累積作用的結(jié)果[2]。為此，研究胃癌發(fā)病的相關(guān)性遺傳因子，以期用于胃癌的篩查高危人群、早期預(yù)防以及臨床治療。纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)g)是一種源至于肝細(xì)胞生產(chǎn)的大分子糖蛋白，參與凝血過(guò)程促進(jìn)血栓形成[3-4]。大多數(shù)惡性腫瘤患者存在凝血異常改變，這種改變表現(xiàn)在體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞既可能同時(shí)激發(fā)肝細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的Fg，也可能同時(shí)通過(guò)分解形成相應(yīng)的纖維蛋白，從而為癌細(xì)胞的浸潤(rùn)、生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移提供結(jié)構(gòu)上的支持；此外，F(xiàn)g也可作為一種黏附分子的配體，使癌細(xì)胞與血小板之間的黏附結(jié)合更加緊密[5]。Fg由6條多肽鏈通過(guò)二硫鍵連接成的對(duì)稱性二聚體，分別由3個(gè)獨(dú)立的基因FgA、FgB和FgG編碼，其中FgB編碼的β鏈?zhǔn)荈g合成的限速步驟，同時(shí)也是血漿功能表達(dá)的主導(dǎo)因素[6-7]，認(rèn)為編輯β鏈的基因通常是影響血漿Fg濃度的主要因素，所以當(dāng)前的研究探索大多聚焦于FgB基因的多態(tài)性分析上[8-11]。在FgBβ鏈基因多態(tài)性位點(diǎn)的研究中，對(duì)于近5′端的第1內(nèi)含子1689T/ G和3′端非轉(zhuǎn)錄區(qū)的HinfIA/C位點(diǎn)的研究較少[12]，為了對(duì)FgB的 β鏈-1689T/G以及HinfIA/C位點(diǎn)基因多態(tài)性進(jìn)行研究，本研究利用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(polymerase chain reaction- restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)方法探討胃癌與其基因多態(tài)性的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標(biāo)本來(lái)源 收集2013年6月—2015年2月151例經(jīng)病理活檢確診GC患者的血液標(biāo)本(所有病例為漢族人群、且無(wú)血緣關(guān)系)，研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)【批件號(hào)：2020倫審第(108)號(hào)】，患者及家屬簽署《知情同意書(shū)》，女性患者62人、男性患者89人， 26～85歲、平均67歲；其中Ⅰ期患者有36人、Ⅱ期患者有29人、Ⅲ期患者有73人、Ⅳ期患者有13人。對(duì)照組是151名健康體檢者，其中女性60人、男91人， 29～86歲，平均64歲。胃癌組和對(duì)照組之間的性別、年齡分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.1.2主要試劑和儀器 引物合成為生工生物工程技術(shù)有限公司；瓊脂糖(BIOWEST公司)，2×Hotstart Taq PCR Master Mix (天根生化科技有限公司)，限制性內(nèi)切酶 Ava Ⅱ(MBI Fermentas公司)，限制性內(nèi)切酶 HinfⅠ(MBI Fermentas公司)。 TGL-16高速離心機(jī)(國(guó)華電子設(shè)備公司)，DYY-III-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(六一儀器廠)，PE9700擴(kuò)增儀(Applied Biosystems公司)，DNA成像分析器Gel Doc EQ(Bio-Rad公司)。引物序列及內(nèi)切酶見(jiàn)表1。

表1 引物序列及內(nèi)切酶Tab.1 Primer sequences and endonuclease

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本收集 收集胃癌組及對(duì)照組的空腹全血(EDTA-K2抗凝)各151份，采集后使用酚-氯仿法提取白細(xì)胞層中的基因組DNA，并保存于-20 ℃的環(huán)境中備用。

1.2.2基因型檢測(cè) 通過(guò)PCR-RFLP技術(shù)對(duì)FgB的 β鏈-HinfIA/C和β鏈-1689位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。FgB的β鏈-1689及-HinfIA/C位點(diǎn)的引物序列設(shè)計(jì)參考元小冬等人[13]的方法。25 μL PCR 反應(yīng)體系中特異性引物取1 μL、DNA模板取1 μL、上，下游引物取1 μL、2×Hotstart Taq PCR Master Mix取13 μL，共計(jì)16 μL，再補(bǔ)ddH2O 9 μL至25 μL。PCR的反應(yīng)條件為：溫度調(diào)節(jié)至 95 ℃后預(yù)變性5 min，繼續(xù)在95 ℃環(huán)境溫度中變性60 s，再調(diào)節(jié)環(huán)境溫度至54 ℃并退火55 s，調(diào)節(jié)環(huán)境溫度至72 ℃延伸60 s，相同的步驟擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后在72 ℃的環(huán)境溫度中延伸5 min；取其8 μL，加入Buffer2 μL和內(nèi)切酶AvaⅡ/HinfⅠ 0.9 μL，再用ddH2O補(bǔ)至20 μL；將上述液體混勻后并進(jìn)行瞬時(shí)離心，再將離心后的液體放進(jìn)37 ℃的恒溫水浴箱中進(jìn)行16 h的水浴，最后通過(guò)2%瓊脂糖凝腔電泳和EB染色，最后置于凝膠成像系統(tǒng)下進(jìn)行觀察，記錄其實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher’s精確檢驗(yàn)(性別、年齡、基因型)。等位基因頻率采用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算，χ2檢驗(yàn)通過(guò)基因型的Hardy-Weinberg平衡吻合度來(lái)驗(yàn)證。多態(tài)性位點(diǎn)間的連鎖不平衡關(guān)系應(yīng)用SHEsis 在線軟件(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)計(jì)算連鎖不平衡系數(shù)，病例對(duì)照研究中應(yīng)用SHEsis 在線軟件構(gòu)建單倍型，如單倍體型頻率<3%時(shí)、將被自動(dòng)刪除，不再進(jìn)行后續(xù)分析，并計(jì)算相對(duì)危險(xiǎn)度的比值比(OddsRatio，OR)及95%CI。FgBβ鏈多態(tài)性位點(diǎn)與胃癌患病風(fēng)險(xiǎn)之間的相關(guān)性用OR及其95%CI表示。

2 結(jié)果

2.1 兩基因位點(diǎn)基因型

2.1.1FgBβ鏈-1689T/G基因多態(tài)性FgBβ鏈-1689T/G基因多態(tài)性呈T-G兩態(tài)，其中G等位基因中含有AvaⅡ酶切位點(diǎn)，如果當(dāng)G突變?yōu)門的時(shí)候，結(jié)果顯示G等位基因就會(huì)丟失AvaⅡ酶切位點(diǎn)，1689位點(diǎn)TT型表現(xiàn)為252 bp片段，TG型表現(xiàn)為252 bp、192 bp和60 bp片段，而其中的GG型則表現(xiàn)為60 bp和192 bp兩個(gè)片段。見(jiàn)圖1。

注：M為DNA Marker， 1、2、3、5、6、8、10為TT基因型，4、7 為TG基因型，9為GG基因型。圖1 FgB β鏈-1689T/G位點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis of FgB β chain-1689T/G site

2.1.2FgBβ鏈-HinfⅠA/C基因多態(tài)性FgBβ鏈-HinfⅠA/C基因多態(tài)性呈A-C兩態(tài)，其中在A等位基因上存在著HinfⅠ酶切位點(diǎn)，如果基因位點(diǎn)上的A變異為C時(shí)，結(jié)果顯示A等位基因就會(huì)丟失HinfⅠ酶切位點(diǎn)；其中在HinfⅠ基因位點(diǎn)上的CC型表達(dá)出240 bp一個(gè)片段，而AA型則分別展示出100 bp及140 bp兩個(gè)片段，剩下的AC型則分別表達(dá)出100 bp、140 bp及240 bp片段。見(jiàn)圖2。

注： M為DNA Marker，1、2、4、5、6、8、10為 AA基因型，3、7 為AC基因型，9為CC基因型。圖2 FgB β鏈-HinfⅠA/C位點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.2 Agarose gel electrophoresis of FgB β chain-HinfⅠA/C at A/C site

2.2 兩組人群的性別及年齡的分布比較

結(jié)果表明，胃癌組年齡、性別分布與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.468，P>0.05；χ2=0.055，P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 胃癌組和對(duì)照組的性別及年齡分布[n(%)]Tab.2 Comparison of gender and age distribution between the gastric cancer group and the control group[n(%)]

2.3 FgB β鏈-1689T/G和β鏈-HinfIA/C基因型頻率的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

采用χ2檢驗(yàn)對(duì)胃癌組及對(duì)照組的FgBβ鏈-1689T/G、HinfIA/C的基因型頻率進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，提示本項(xiàng)研究人群具有群體代表性。見(jiàn)表3。

表3 FgB β鏈-1689T/G和HinfIA/C基因位點(diǎn)基因型頻率Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)Tab.3 The Hardy-Weinberg balance test of the genotype frequency of two gene loci of FgB β chain-1689T/G and HinfIA/C

2.4 FgB β鏈-1689T/G和β鏈-HinfIA/C基因多態(tài)性與胃癌的臨床分期、轉(zhuǎn)移的關(guān)系

不同病理分期和有、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者FgBβ鏈-1689T/G和HinfIA/C基因的基因型的分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示FgBβ鏈-1689T/G和β鏈-HinfIA/C基因多態(tài)性與胃癌的臨床分期及轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。見(jiàn)表4。

表4 FgB β鏈-1689T/G和HinfIA/C位點(diǎn)的基因多態(tài)性與臨床病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系Tab.4 The relationship between genetic polymorphisms of FgB β chain-1689T/G and HinfIA/C loci with different pathological stages and the presence or absence of lymph node metastasis

2.5 胃癌組及對(duì)照組FgB β鏈-1689T/G和β鏈-HinfIA/C基因型分布和等位基因頻率分布

結(jié)果顯示， 胃癌組FgBβ鏈-1689T/G位點(diǎn)不同基因型及等位基因分布與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；FgBβ鏈-HinfⅠA/C位點(diǎn)的基因型和等位基因在胃癌組與對(duì)照組之間的分布上均具有相關(guān)性 (P<0.05)。提示FgBβ鏈-HinfⅠA/C位點(diǎn)基因多態(tài)性可能與胃癌發(fā)病相關(guān)。見(jiàn)表5。

表5 胃癌組及對(duì)照組FgB β鏈-1689T/G、HinfIA/C基因型和等位基因頻率分布[n(%)]Tab.5 FgB β chain-1689T/G, HinfIA/C genotype and allele frequency distribution in gastric cancer group and control group[n(%)]

2.6 FgB β鏈-1689T/G和FgB β鏈-HinfIA/C位點(diǎn)不同基因型在胃癌中的OR分析

通過(guò)OR分析FgBβ鏈-1689T/G和β鏈-HinfIA/C基因與胃癌發(fā)病的相關(guān)性，結(jié)果顯示，F(xiàn)gBβ鏈-1689T/G位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率與胃癌發(fā)病沒(méi)有關(guān)聯(lián)性，F(xiàn)gBβ鏈-HinfⅠA/C位點(diǎn)的AC基因型和C等位基因與胃癌有相關(guān)性(95%CI為1.105～3.224，OR=1.888，χ2=5.488，P<0.05；OR=1.737，95%CI為1.100～2.741，χ2=5.706，P<0.05)。提示AC基因型和C等位基因與胃癌的發(fā)病相關(guān)。見(jiàn)表6。

表6 FgB β鏈-1689T/G和HinfIA/C位點(diǎn)各基因型及等位基因?qū)ξ赴┑南鄬?duì)危險(xiǎn)度[n (%)]Tab.6 The relative risk of each genotype and allele of FgB β chain-1689T/G and HinfIA/C to gastric cancer[n (%)]

2.7 胃癌組和對(duì)照組FgB β鏈-1689T/G和β鏈-HinfⅠA/C位點(diǎn)基因連鎖不平衡分析

通過(guò)計(jì)算連鎖不平衡系數(shù)分析基因間是否存在連鎖平衡。結(jié)果顯示，F(xiàn)gBβ鏈-1689T/G和β鏈-HinfⅠA/C位點(diǎn)在胃癌組為弱連鎖不平衡(r2=0.017)，在對(duì)照組為弱連鎖不平衡(r2=0.032)。見(jiàn)表7。

表7 FgB β鏈-1689T/G和HinfIA/C位點(diǎn)的連鎖不平衡分析Tab.7 Analysis of linkage disequilibrium between FgB β chain-1689T/G and HinfIA/C

2.8 FgB β鏈-1689T/G和β鏈-HinfⅠA/C位點(diǎn)的單倍體型分析及各單倍體型對(duì)胃癌的相對(duì)危險(xiǎn)度比較

結(jié)果顯示，胃癌組T*A單倍體型和對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.239，P<0.05)，提示T*A單倍體型可能與胃癌發(fā)病有關(guān)聯(lián)(OR=1.430，95%CI為1.017～2.011)。T*C 和G*A 單倍體型在胃癌組和對(duì)照組之間的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.336，P>0.05；χ2=0.167，P>0.05)。G*C單倍體型分布頻率因2組均<3%、而被刪除，不再繼續(xù)進(jìn)行分析。見(jiàn)表8。

表8 FgB β鏈-1689T/G、HinfIA/C位點(diǎn)的單倍體型分析及各單倍體型對(duì)胃癌的OR比較Tab.8 Haplotype analysis of the two gene loci of FgB β chain-1689T/G and HinfIA/C and comparison of OR of each haplotype to gastric cancer

3 討論

Fg作為體內(nèi)重要的凝血因子之一，它的調(diào)控功能和功能表達(dá)的研究熱度居高不下。在近年的研究中，Humphries等[14]揭示Fg的三條鏈具有多個(gè)基因多態(tài)性的位點(diǎn)，并對(duì)基因的遺傳調(diào)控在Fg表達(dá)水平上的影響進(jìn)行了初步研究，顯示大概有51%的Fg表達(dá)水平異常和結(jié)構(gòu)功能異常與基因遺傳缺陷有一定的相關(guān)性[15]；也有學(xué)者認(rèn)為在FgBβ鏈合成mRNA 的過(guò)程是調(diào)節(jié)Fg 分子合成的關(guān)鍵步驟，因此它的基因?qū)W特點(diǎn)是決定Fg功能表達(dá)的重要影響因素之一[16]。另外，研究顯示在基因的結(jié)構(gòu)上，F(xiàn)gBα鏈位于整個(gè)基因群的中間，而γ鏈和β鏈基因位于基因群的兩側(cè)，鏈和鏈基因被前后串聯(lián)在一起，向模板鏈基因相反的方向進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，這3種基因的轉(zhuǎn)錄是相互協(xié)調(diào)進(jìn)行的，如果增加其中一條鏈的mRNA 轉(zhuǎn)錄也能增加其它兩條鏈的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而增加了Fg的分泌和合成。 整個(gè)FgBβ鏈的轉(zhuǎn)錄區(qū)擁有8.1 kb的基因長(zhǎng)度，7個(gè)內(nèi)含子占據(jù)6.2 kb，大概占據(jù)總長(zhǎng)度的76.5%，而剩下的8個(gè)外顯子僅占據(jù)基因總長(zhǎng)度23.5%，只有1.9 kb。由于絕大多數(shù)的基因突變發(fā)生在內(nèi)含子當(dāng)中，而且內(nèi)含子區(qū)域里的基因位點(diǎn)并沒(méi)有直接參與到mRNA轉(zhuǎn)錄合成，這些因素導(dǎo)致了人體對(duì)基因突變的耐受能力得到了顯著增加。

在本次研究中，胃癌組和對(duì)照組的性別、年齡分布差異都無(wú)相關(guān)性，而且這兩個(gè)基因的多態(tài)性位點(diǎn)在胃癌組及對(duì)照組的等位基因頻率分布都與Hardy-Weinberg 平衡定律相吻合，提示此次研究的人群具有群體代表性。本研究結(jié)果顯示FgBβ鏈-1689T/G等位基因G頻率為 20.5% ，與LiuY等[17]報(bào)道的G1689頻率24.0%接近，與吳方等人[18]對(duì)上海正常人群G1689頻率研究結(jié)果為55.2%相比過(guò)低。在本次的研究中發(fā)現(xiàn)FgBβ鏈-HinfIA/C等位基因C頻率為11. 6%，有學(xué)者對(duì)我國(guó)海南正常漢族人群中的C頻率研究結(jié)果為13.4%[19]，這與本研究的結(jié)果基本相同。在本次研究中，F(xiàn)gBβ鏈-1689T/G位點(diǎn)的基因型和等位基因的分布在兩組被檢者之間沒(méi)有差異性，而FgBβ鏈-HinfIA/C位點(diǎn)的基因型和等位基因在兩組之間之間有差異性，提示FgBβ鏈-HinfIA/C位點(diǎn)基因多態(tài)性與胃癌的發(fā)病有一定的相關(guān)性。胃癌組危險(xiǎn)度評(píng)價(jià)結(jié)果顯示， 在FgBβ鏈-1689T/G位點(diǎn)中以TT基因型和T等位基因相比較，有TG、GG 基因型和G等位基因的胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)分別是有TT基因型和T等位基因的1.236倍、0.911倍和0.901倍，P>0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在FgBβ鏈-HinfIA/C位點(diǎn)中以AA型和A等位基因相比較，結(jié)果顯示，有AC基因型和C等位基因的胃癌發(fā)病率是有A等位基因的1.737倍、P=0.017，是有AA基因型的1.888倍、P=0.019，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而有突變純合子CC型胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是擁有AA型的1.983倍、P>0.05，沒(méi)有明顯差異性，由此得出FgBβ鏈-HinfIA/C位點(diǎn)基因的突變可能是胃癌發(fā)生的重要因素。另外，C等位基因可能也是胃癌發(fā)生的因素之一，對(duì)FgBβ鏈-HinfIA/C和β鏈-1689T/G基因的多態(tài)性與胃癌的轉(zhuǎn)移及臨床分期相比較，可以發(fā)現(xiàn)FgBβ鏈-HinfIA/C和β鏈-1689T/G位點(diǎn)的基因多態(tài)性在胃癌的轉(zhuǎn)移及臨床分期方面均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

通過(guò)基因連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)gBβ鏈-1689T/G和β鏈-HinfⅠA/C之間存在弱連鎖不平衡，這與元小冬等[13]、梁亮等[20]的研究結(jié)果一致。對(duì)胃癌組及對(duì)照組FgBβ鏈-1689T/G和HinfIA/C間的配對(duì)單倍體型分析，當(dāng)FgBβ鏈-1689T/G和β鏈-HinfIA/C兩位點(diǎn)間呈單倍體型T*A時(shí)、胃癌的發(fā)病率明顯高于對(duì)照組，而當(dāng)其呈單倍體型T*C時(shí)、胃癌的發(fā)病率明顯低于對(duì)照組，此結(jié)果提示當(dāng)?shù)任换騎1689和AHinfⅠ同時(shí)存在時(shí)可能存在協(xié)同作用、從而增加胃癌發(fā)生的危險(xiǎn)性，而單倍型T*C可能與降低胃癌的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，可能是保護(hù)性單倍體型。

本項(xiàng)研究結(jié)果提示，F(xiàn)gBβ鏈-HinfIA/C和β鏈-1689T/G位點(diǎn)的基因多態(tài)性與胃癌的發(fā)病存在較大的相關(guān)性，兩位點(diǎn)間形成的T*A單倍體型能極增加胃癌的發(fā)生率(P<0.05)，而單倍體型T*C能降低胃癌的發(fā)生率；另外，F(xiàn)gBβ鏈-HinfIA/C位點(diǎn)的C等位基因有可能是胃癌發(fā)生的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素之一。