天麻苷元脂質(zhì)體制備及藥劑學(xué)性能研究*

邱紅燕，劉學(xué)，周雪，吳林菁，肖婷，茅向軍，沈祥春***，陶玲***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省天然藥物資源高效利用工程中心 & 貴州醫(yī)科大學(xué)-貴陽市聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 & 貴州省高等學(xué)校天然藥物藥理與成藥性評價特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 & 天然藥物資源優(yōu)效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省食品藥品檢驗(yàn)所， 貴州 貴陽 550004)

天麻是蘭科植物(GastrodiaelataBl.)的干燥塊莖，天麻苷元(gstrodin)與天麻素(gastrodigenin)是天麻的主要有效成分，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗癲癇、抗驚厥等藥理作用[1-2]。目前，天麻素已有多種制劑被廣泛用于頭痛、眩暈等疾病的治療，其藥理作用的研究及其作用機(jī)制的探討也逐漸趨于全面，而尚未見天麻苷元相關(guān)制劑在臨床上應(yīng)用。天麻苷元為對羥基苯甲醇，相對分子質(zhì)量更小，具有脂水兩親性、跨膜能力較強(qiáng)以及更易進(jìn)入腦內(nèi)的特點(diǎn)。有研究指出，靜脈注射相同劑量的天麻素及天麻苷元，后者腦脊液中的血藥濃度-時間曲線下面積(area under curve，AUC)明顯高于前者[3]。還有研究顯示，天麻苷元極有可能是天麻素通過血腦屏障后留存在腦組織中發(fā)揮中樞作用的藥效成分[4]。因此，近年來天麻苷元逐漸被人們所重視，是一個具有良好開發(fā)前景的藥物。但是天麻苷元較難溶于水，口服生物利用度低，局限了其臨床治療效果的發(fā)揮[5-6]。脂質(zhì)體作為一種新型藥物載體，具有生物利用度高、生物相容性好、促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)以及提高藥物穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)[7-9]。本研究采用薄膜-超聲分散法進(jìn)行天麻苷元脂質(zhì)體制備，采用超濾離心法進(jìn)行天麻苷元脂質(zhì)體包封率的測定，并以包封率(entrapped efficiency，EE)、平均粒徑、粒徑范圍和多分散指數(shù)(polydispersity index，PDI)為評價指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)的考察，篩選出天麻苷元脂質(zhì)體的最佳制備工藝。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試藥

Waterse2695型高效液相色譜儀(美國沃特世公司)、NANOJ H10型高速剪切乳化機(jī)(ATS工業(yè)系統(tǒng)有限公司)、HB ECO S096型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國IKA公司)、KQ-300DE型數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、ME104/02型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]、UPW-UP-10型純水儀(成都天莘寧科技有限公司)、AH-NANO型高壓均質(zhì)機(jī)(ATS工業(yè)系統(tǒng)有限公司)、LF-1型脂質(zhì)體擠出器(AVESTIN公司)、NANO-ZS型粒度及Zeta電位測定儀(英國馬爾文儀器有限公司)。天麻苷元(純度>98%，批號P1372734，Adamas試劑有限公司)、大豆磷脂(批號201908012，上海太偉藥業(yè)股份有限公司)、膽固醇(批號20200325，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、乙腈(色譜純，美國Tedia試劑公司)、甲醇(色譜純，美國Tedia試劑公司)、水為實(shí)驗(yàn)室一級水，其他試劑試藥均為分析純。

1.2 研究方法

1.2.1色譜條件 采用Ultimate?AQ-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為甲醇 ∶水=5 ∶95，檢測波長220 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.2.2溶液的制備 稱取天麻苷元對照品13.14 mg，甲醇超聲溶解并定容至50 mL，再吸取1 mL置于50 mL量瓶中，甲醇定容，得濃度為5.256 mg/L的天麻苷元對照品溶液。吸取按照最優(yōu)處方制備的脂質(zhì)體溶液0.1 mL置棕色量瓶中，甲醇適量，超聲，定容至100 mL，搖勻，即得天麻苷元脂質(zhì)體供試品溶液。同法制備空白脂質(zhì)體溶液。

1.2.3專屬性 取上述對照品溶液及供試品溶液、空白脂質(zhì)體溶液適量，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。

1.2.4方法學(xué)考察 (1)線性關(guān)系考察：吸取“1.2.2”項(xiàng)下天麻苷元對照品溶液4、8、12、16、20 μL，注入高效液相色譜儀，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定；(2)精密度試驗(yàn)：取對照品溶液(5.256 mg/L)，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，按“1.2.1”法連續(xù)測定6次，記錄峰面積，計算峰面積的RSD值；(3)重復(fù)性試驗(yàn)：吸取脂質(zhì)體6份，按“1.2.2”項(xiàng)下方法處理天麻苷元脂質(zhì)體，并按“1.2.1”法進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計算峰面積的RSD；(4)穩(wěn)定性試驗(yàn)：吸取脂質(zhì)體1份，按“1.2.2”項(xiàng)下方法處理天麻苷元脂質(zhì)體，別在 0、2、4、6、8、12以及24 h進(jìn)樣，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定并記錄峰面積，計算峰面積的RSD值；(5)加樣回收率試驗(yàn)：吸取天麻苷元脂質(zhì)體6份適量，分別加入等量的天麻苷元對照品，按“1.2.2”項(xiàng)下方法處理天麻苷元脂質(zhì)體，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積，帶入線性方程，計算其平均回收率和RSD值。

1.2.5EE的測定[10-13]取天麻苷元脂質(zhì)體3 mL于超濾管(50 kDa)中，4 000 r/min離心10 min，取續(xù)濾液適量置于10 mL量瓶中，甲醇定容，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計算得游離藥物含量(W游)。取0.1 mL天麻苷元脂質(zhì)體溶液于10 mL量瓶中，甲醇定容，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，為天麻苷元脂質(zhì)體中的含藥量(W總)。根據(jù)下列公式計算EE，EE%=(W總-W游)/W總×100%。

1.2.6天麻苷元脂質(zhì)體的制備 參考文獻(xiàn)[14-18]和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定通過以下單因素實(shí)驗(yàn)進(jìn)行處方和工藝優(yōu)化。(1)天麻苷元與大豆磷脂質(zhì)量比例的考察，固定膽固醇與大豆磷脂的質(zhì)量比為1 ∶4，50 ℃旋蒸30 min，用超純水10 mL作為水合介質(zhì)，50 ℃水合30 min，50 ℃超聲10 min，10 000 r/min高速剪切3 min，依次過0.8、0.4、0.1 μm濾膜各3次，以EE、平均粒徑、粒徑范圍和PDI作為天麻苷元脂質(zhì)體的評價指標(biāo)，考察天麻苷元與大豆磷脂的比例為1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4、1 ∶5 對制備天麻苷元脂質(zhì)體的影響；(2)膽固醇與大豆磷脂質(zhì)量比例的考察，固定天麻苷元與大豆磷脂的質(zhì)量比為3 ∶1，50 ℃旋蒸30 min，用超純水10 mL 作為水合介質(zhì)，50 ℃水合30 min，50 ℃超聲10 min，10 000 r/min高速剪切3 min，依次過0.8、0.4、0.1 μm濾膜各3次，以EE、平均粒徑、粒徑范圍和PDI作為天麻苷元脂質(zhì)體的評價指標(biāo)，考察膽固醇與大豆磷脂比例為3 ∶1、4 ∶1、5 ∶1對制備天麻苷元脂質(zhì)體的影響；(3)旋蒸溫度的考察，固定天麻苷元與大豆磷脂的質(zhì)量比為1 ∶3，大豆磷脂與膽固醇質(zhì)量比為3 ∶1，旋蒸時間為30 min，用10 mL 超純水作為水合介質(zhì)，50 ℃水合30 min，50℃超聲10 min，10 000 r/min高速剪切3 min，依次過0.8、0.4、0.1 μm濾膜各3次，以EE、平均粒徑、粒徑范圍和PDI作為天麻苷元脂質(zhì)體的評價指標(biāo)，考察旋蒸溫度40、50以及60 ℃對制備天麻苷元脂質(zhì)體的影響；(4)水合溫度的考察，固定天麻苷元與大豆磷脂的質(zhì)量比為1 ∶3，膽固醇與大豆磷脂質(zhì)量比為1 ∶3，50℃旋蒸30 min，用10 mL 超純水作為水合介質(zhì)，水合時間為30 min，50℃超聲10 min，10 000 r/min高速剪切3 min，依次過0.8、0.4、0.1 μm濾膜各3次，以EE、平均粒徑、粒徑范圍和PDI作為天麻苷元脂質(zhì)體的評價指標(biāo)，考察水合溫度為40、50以及60 ℃對制備的天麻苷元脂質(zhì)體影響；(5)水合時間的考察，固定天麻苷元與大豆磷脂的質(zhì)量比為1 ∶3，膽固醇與大豆磷脂質(zhì)量比為1 ∶3，50 ℃旋蒸30 min，以超純水10 mL 為水合介質(zhì)，水合溫度為50 ℃，50 ℃超聲10 min，10 000 r/min高速剪切3 min，依次過0.8、0.4、0.1 μm濾膜各3次，以EE、平均粒徑、粒徑范圍和PDI作為天麻苷元脂質(zhì)體的評價指標(biāo)，考察水合時間為15、30以及60 min對制備天麻苷元脂質(zhì)體的影響；(6)過濾膜次數(shù)考察，固定天麻苷元與大豆磷脂的質(zhì)量比為1 ∶3，膽固醇與大豆磷脂質(zhì)量比為1 ∶3，50 ℃旋蒸30 min，以超純水10 mL 為水合介質(zhì)，50 ℃水合30 min，50 ℃超聲10 min，10 000 r/min高速剪切3 min，采用脂質(zhì)體擠出器，依次過0.8、0.4 μm濾膜各3次，以EE、平均粒徑、粒徑范圍和PDI作為天麻苷元脂質(zhì)體的評價指標(biāo)，考察過0.1 μm濾膜次數(shù)3、5、7次對制備的天麻苷元脂質(zhì)體影響。稱量天麻苷元40 mg、膽固醇40 mg、豆磷脂120 mg置于15 mL EP管中，加入無水乙醇10 mL，超聲3 min(功率300 W，頻率40 kHz)使其充分溶解，轉(zhuǎn)移至茄形瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40 ℃水浴減壓蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑。加入超純水10 mL作為水合介質(zhì)進(jìn)行洗膜；40 ℃水浴下常壓旋轉(zhuǎn)水合30 min，50 ℃水浴超聲10 min，10 000 r/min高速剪切3 min，再依次過0.8、0.4 μm濾膜各3次，0.1 μm濾膜7次；取續(xù)濾液，即得天麻苷元脂質(zhì)體。

1.2.7最佳處方工藝條件下天麻苷元脂質(zhì)體外觀形態(tài) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，得最佳處方工藝條件，觀察最優(yōu)工藝所制得天麻苷元脂質(zhì)體的外觀。

1.2.8最佳處方工藝條件下EE的測定 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，獲得天麻苷元脂質(zhì)體的最佳處方工藝條件，按“1.2.5”項(xiàng)下方法測定最優(yōu)工藝條件所制得天麻苷元脂質(zhì)體的EE。

1.2.9最佳處方工藝條件下粒徑和PDI考察 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，得最佳處方工藝條件，采用納米激光粒徑分析儀測定最優(yōu)工藝所制得天麻苷元脂質(zhì)體的平均粒徑、粒徑范圍和PDI。

2 結(jié)果

2.1 天麻苷元脂質(zhì)體含量測定

專屬性試驗(yàn)結(jié)果表明，天麻苷元對照品與天麻苷元供試品在色譜相應(yīng)的位置上天麻苷元色譜峰保留時間一致，空白脂質(zhì)體在天麻苷元相應(yīng)出峰時間處無吸收峰，對測定無干擾，專屬性強(qiáng)，見圖1。以進(jìn)樣量(X，ng)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制天麻苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得回歸方程為Y=3 597.90X+305.30(r=0.999 6)，表明天麻苷元在2.10～10.51 mg/L濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好；精密度試驗(yàn)峰面積RSD為1.26%(n=6)，表明儀器的精密度良好；重復(fù)性試驗(yàn)峰面積RSD為1.48%(n=6)，表明該方法的重復(fù)性良好；穩(wěn)定性試驗(yàn)峰面積RSD為1.47%(n=6)，表明天麻苷元供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好；回收率試驗(yàn)，平均加樣回收率為102.59%(n=6)，RSD為1.96%(n=6)，表明該方法回收率良好。

注：A為空白脂質(zhì)體溶液，B為對照品溶液，C為供試品溶液，1為天麻苷元。圖1 對照品及供試品的HPLC色譜結(jié)果Fig.1 HPLC chromatogram of reference substance and sample

2.2 天麻苷元脂質(zhì)體的制備

天麻苷元與大豆磷脂質(zhì)量比例的考察結(jié)果顯示，質(zhì)量比例為1 ∶2時，EE最小，平均粒徑及粒徑范圍最大；質(zhì)量比例為1 ∶3、1 ∶4、1 ∶5的EE和平均粒徑差異不大；質(zhì)量比例為1 ∶3時，PDI及粒徑范圍較小，因此選擇藥物與大豆磷脂質(zhì)量比例為1 ∶3進(jìn)行后續(xù)考察。大豆磷脂與膽固醇比例考察結(jié)果表明，大豆磷脂與膽固醇質(zhì)量比例為5 ∶1時，EE最小，PDI及粒徑范圍最大；質(zhì)量比例為3 ∶1或4 ∶1時EE和平均粒徑差異不大；但是當(dāng)質(zhì)量比例為3 ∶1時，PDI及粒徑范圍較小，因此選擇大豆磷脂與膽固醇質(zhì)量比例為3 ∶1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)考察。旋蒸溫度的考察結(jié)果顯示：溫度為50 ℃時，EE最小；溫度為40、60 ℃的EE差異不大；但當(dāng)溫度為40 ℃時，平均粒徑和粒徑范圍較小，因此選擇旋蒸溫度為40 ℃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后續(xù)考察。水合溫度的考察結(jié)果顯示：溫度40、50、60 ℃的EE差異不大；40 ℃時，平均粒徑、PDI和粒徑范圍均較??；因此，選擇水合溫度為40 ℃進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)考察。水合時間的考察結(jié)果表明，水合時間為15 min時，EE最小，平均粒徑及粒徑范圍最大；時間為30、60 min的平均粒徑及粒徑范圍差異不大，由于水合時間為30 min時EE最大，PDI較小，因此選擇水合時間為30 min進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)考察。過0.1 μm濾膜次數(shù)的考察結(jié)果顯示，次數(shù)為3、5、7次的平均粒徑、PDI及粒徑范圍差異不大；鑒于次數(shù)為7次EE最大，因此選擇過0.1 μm濾膜次數(shù)為7次。

2.3 天麻苷元脂質(zhì)體理化性質(zhì)的初步研究

2.3.1脂質(zhì)體的外觀 按最優(yōu)處方制備的天麻苷元脂質(zhì)體，外觀呈微帶淡藍(lán)色的乳白色混懸液，見圖2。

圖2 天麻苷元脂質(zhì)體的外觀Fig.2 Appearance of Gastrodigenin liposomes

2.3.2脂質(zhì)體的包封率 根據(jù)測得的峰面積，計算得最優(yōu)處方工藝制備的天麻苷元脂質(zhì)體EE為21%。

2.3.3脂質(zhì)體的粒徑、粒徑范圍和PDI 采用馬爾文激光粒度測定儀，測得最優(yōu)處方工藝制備的天麻苷元脂質(zhì)體的平均粒徑為150.39 nm；粒徑范圍為31.84～688.63 nm；PDI為0.129。天麻苷元脂質(zhì)體粒度分布較窄，見圖3。

圖3 天麻苷元脂質(zhì)體的粒徑分布圖Fig.3 Particle size distribution of Gastrodigenin liposome

3 討論

本研究采用乙醇作為綠色溶劑，經(jīng)典的薄膜分散法制備天麻苷元脂質(zhì)體，方法簡單易操作[19-21]，也可應(yīng)用于工業(yè)化大生產(chǎn)。在天麻苷元脂質(zhì)體的處方中，膽固醇起到了膜流動性調(diào)節(jié)劑的作用，大豆磷脂與膽固醇比例的改變對成膜效果有著重要的影響；減壓回收溶劑成膜后，加入水化溶液，在一定的溫度下形成脂質(zhì)體的效果較理想[22-24]。

本文研究考察了天麻苷元與大豆磷脂質(zhì)量比、大豆磷脂與膽固醇質(zhì)量比、旋蒸溫度、水合溫度、水合時間以及過濾膜次數(shù)，從而確定了最優(yōu)處方制備工藝。脂質(zhì)體粒徑范圍為31.84～688.63 nm，分布較窄且在水中分散較好，有效改善了天麻苷元的水溶性。

目前，脂質(zhì)體制備用到的水化介質(zhì)多為水或磷酸鹽緩沖液(具體選擇何種水化介質(zhì)需根據(jù)藥物性質(zhì)確定)，因此制備得到的大多數(shù)載藥脂質(zhì)體均處于水系環(huán)境中，存在脂質(zhì)體融合、藥物滲漏以及磷脂水解等問題，不適合長時間貯存[25]，下一步計劃將天麻苷元脂質(zhì)體混懸液進(jìn)一步制備為天麻苷元脂質(zhì)體凍干制劑，以提高制劑的穩(wěn)定性[26]。