天麻苷元脂質體制備及藥劑學性能研究*

邱紅燕，劉學，周雪，吳林菁，肖婷，茅向軍，沈祥春***，陶玲***

(1.貴州醫科大學 貴州省天然藥物資源高效利用工程中心 & 貴州醫科大學-貴陽市聯合重點實驗室 & 貴州省高等學校天然藥物藥理與成藥性評價特色重點實驗室 & 天然藥物資源優效利用重點實驗室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省食品藥品檢驗所， 貴州 貴陽 550004)

天麻是蘭科植物(GastrodiaelataBl.)的干燥塊莖，天麻苷元(gstrodin)與天麻素(gastrodigenin)是天麻的主要有效成分，具有鎮靜、鎮痛、抗癲癇、抗驚厥等藥理作用[1-2]。目前，天麻素已有多種制劑被廣泛用于頭痛、眩暈等疾病的治療，其藥理作用的研究及其作用機制的探討也逐漸趨于全面，而尚未見天麻苷元相關制劑在臨床上應用。天麻苷元為對羥基苯甲醇，相對分子質量更小，具有脂水兩親性、跨膜能力較強以及更易進入腦內的特點。有研究指出，靜脈注射相同劑量的天麻素及天麻苷元，后者腦脊液中的血藥濃度-時間曲線下面積(area under curve，AUC)明顯高于前者[3]。還有研究顯示，天麻苷元極有可能是天麻素通過血腦屏障后留存在腦組織中發揮中樞作用的藥效成分[4]。因此，近年來天麻苷元逐漸被人們所重視，是一個具有良好開發前景的藥物。但是天麻苷元較難溶于水，口服生物利用度低，局限了其臨床治療效果的發揮[5-6]。脂質體作為一種新型藥物載體，具有生物利用度高、生物相容性好、促進轉運以及提高藥物穩定性等優點[7-9]。本研究采用薄膜-超聲分散法進行天麻苷元脂質體制備，采用超濾離心法進行天麻苷元脂質體包封率的測定，并以包封率(entrapped efficiency，EE)、平均粒徑、粒徑范圍和多分散指數(polydispersity index，PDI)為評價指標進行單因素實驗的考察，篩選出天麻苷元脂質體的最佳制備工藝。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與試藥

Waterse2695型高效液相色譜儀(美國沃特世公司)、NANOJ H10型高速剪切乳化機(ATS工業系統有限公司)、HB ECO S096型旋轉蒸發儀(德國IKA公司)、KQ-300DE型數控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、ME104/02型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]、UPW-UP-10型純水儀(成都天莘寧科技有限公司)、AH-NANO型高壓均質機(ATS工業系統有限公司)、LF-1型脂質體擠出器(AVESTIN公司)、NANO-ZS型粒度及Zeta電位測定儀(英國馬爾文儀器有限公司)。天麻苷元(純度>98%，批號P1372734，Adamas試劑有限公司)、大豆磷脂(批號201908012，上海太偉藥業股份有限公司)、膽固醇(批號20200325，國藥集團化學試劑有限公司)、乙腈(色譜純，美國Tedia試劑公司)、甲醇(色譜純，美國Tedia試劑公司)、水為實驗室一級水，其他試劑試藥均為分析純。

1.2 研究方法

1.2.1色譜條件 采用Ultimate?AQ-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為甲醇 ∶水=5 ∶95，檢測波長220 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

1.2.2溶液的制備 稱取天麻苷元對照品13.14 mg，甲醇超聲溶解并定容至50 mL，再吸取1 mL置于50 mL量瓶中，甲醇定容，得濃度為5.256 mg/L的天麻苷元對照品溶液。吸取按照最優處方制備的脂質體溶液0.1 mL置棕色量瓶中，甲醇適量，超聲，定容至100 mL，搖勻，即得天麻苷元脂質體供試品溶液。同法制備空白脂質體溶液。

1.2.3專屬性 取上述對照品溶液及供試品溶液、空白脂質體溶液適量，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，按“1.2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。

1.2.4方法學考察 (1)線性關系考察：吸取“1.2.2”項下天麻苷元對照品溶液4、8、12、16、20 μL，注入高效液相色譜儀，按“1.2.1”項下色譜條件進行測定；(2)精密度試驗：取對照品溶液(5.256 mg/L)，經0.22 μm微孔濾膜濾過，按“1.2.1”法連續測定6次，記錄峰面積，計算峰面積的RSD值；(3)重復性試驗：吸取脂質體6份，按“1.2.2”項下方法處理天麻苷元脂質體，并按“1.2.1”法進樣測定，記錄峰面積，計算峰面積的RSD；(4)穩定性試驗：吸取脂質體1份，按“1.2.2”項下方法處理天麻苷元脂質體，別在 0、2、4、6、8、12以及24 h進樣，按“1.2.1”項下色譜條件進行測定并記錄峰面積，計算峰面積的RSD值；(5)加樣回收率試驗：吸取天麻苷元脂質體6份適量，分別加入等量的天麻苷元對照品，按“1.2.2”項下方法處理天麻苷元脂質體，按“1.2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，帶入線性方程，計算其平均回收率和RSD值。

1.2.5EE的測定[10-13]取天麻苷元脂質體3 mL于超濾管(50 kDa)中，4 000 r/min離心10 min，取續濾液適量置于10 mL量瓶中，甲醇定容，按“1.2.1”項下色譜條件進樣測定，計算得游離藥物含量(W游)。取0.1 mL天麻苷元脂質體溶液于10 mL量瓶中，甲醇定容，按“1.2.1”項下色譜條件進樣測定，為天麻苷元脂質體中的含藥量(W總)。根據下列公式計算EE，EE%=(W總-W游)/W總×100%。

1.2.6天麻苷元脂質體的制備 參考文獻[14-18]和預實驗結果，確定通過以下單因素實驗進行處方和工藝優化。(1)天麻苷元與大豆磷脂質量比例的考察，固定膽固醇與大豆磷脂的質量比為1 ∶4，50 ℃旋蒸30 min，用超純水10 mL作為水合介質，50 ℃水合30 min，50 ℃超聲10 min，10 000 r/min高速剪切3 min，依次過0.8、0.4、0.1 μm濾膜各3次，以EE、平均粒徑、粒徑范圍和PDI作為天麻苷元脂質體的評價指標，考察天麻苷元與大豆磷脂的比例為1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4、1 ∶5 對制備天麻苷元脂質體的影響；(2)膽固醇與大豆磷脂質量比例的考察，固定天麻苷元與大豆磷脂的質量比為3 ∶1，50 ℃旋蒸30 min，用超純水10 mL 作為水合介質，50 ℃水合30 min，50 ℃超聲10 min，10 000 r/min高速剪切3 min，依次過0.8、0.4、0.1 μm濾膜各3次，以EE、平均粒徑、粒徑范圍和PDI作為天麻苷元脂質體的評價指標，考察膽固醇與大豆磷脂比例為3 ∶1、4 ∶1、5 ∶1對制備天麻苷元脂質體的影響；(3)旋蒸溫度的考察，固定天麻苷元與大豆磷脂的質量比為1 ∶3，大豆磷脂與膽固醇質量比為3 ∶1，旋蒸時間為30 min，用10 mL 超純水作為水合介質，50 ℃水合30 min，50℃超聲10 min，10 000 r/min高速剪切3 min，依次過0.8、0.4、0.1 μm濾膜各3次，以EE、平均粒徑、粒徑范圍和PDI作為天麻苷元脂質體的評價指標，考察旋蒸溫度40、50以及60 ℃對制備天麻苷元脂質體的影響；(4)水合溫度的考察，固定天麻苷元與大豆磷脂的質量比為1 ∶3，膽固醇與大豆磷脂質量比為1 ∶3，50℃旋蒸30 min，用10 mL 超純水作為水合介質，水合時間為30 min，50℃超聲10 min，10 000 r/min高速剪切3 min，依次過0.8、0.4、0.1 μm濾膜各3次，以EE、平均粒徑、粒徑范圍和PDI作為天麻苷元脂質體的評價指標，考察水合溫度為40、50以及60 ℃對制備的天麻苷元脂質體影響；(5)水合時間的考察，固定天麻苷元與大豆磷脂的質量比為1 ∶3，膽固醇與大豆磷脂質量比為1 ∶3，50 ℃旋蒸30 min，以超純水10 mL 為水合介質，水合溫度為50 ℃，50 ℃超聲10 min，10 000 r/min高速剪切3 min，依次過0.8、0.4、0.1 μm濾膜各3次，以EE、平均粒徑、粒徑范圍和PDI作為天麻苷元脂質體的評價指標，考察水合時間為15、30以及60 min對制備天麻苷元脂質體的影響；(6)過濾膜次數考察，固定天麻苷元與大豆磷脂的質量比為1 ∶3，膽固醇與大豆磷脂質量比為1 ∶3，50 ℃旋蒸30 min，以超純水10 mL 為水合介質，50 ℃水合30 min，50 ℃超聲10 min，10 000 r/min高速剪切3 min，采用脂質體擠出器，依次過0.8、0.4 μm濾膜各3次，以EE、平均粒徑、粒徑范圍和PDI作為天麻苷元脂質體的評價指標，考察過0.1 μm濾膜次數3、5、7次對制備的天麻苷元脂質體影響。稱量天麻苷元40 mg、膽固醇40 mg、豆磷脂120 mg置于15 mL EP管中，加入無水乙醇10 mL，超聲3 min(功率300 W，頻率40 kHz)使其充分溶解，轉移至茄形瓶中，旋轉蒸發儀40 ℃水浴減壓蒸發去除有機溶劑。加入超純水10 mL作為水合介質進行洗膜；40 ℃水浴下常壓旋轉水合30 min，50 ℃水浴超聲10 min，10 000 r/min高速剪切3 min，再依次過0.8、0.4 μm濾膜各3次，0.1 μm濾膜7次；取續濾液，即得天麻苷元脂質體。

1.2.7最佳處方工藝條件下天麻苷元脂質體外觀形態 根據單因素試驗結果，得最佳處方工藝條件，觀察最優工藝所制得天麻苷元脂質體的外觀。

1.2.8最佳處方工藝條件下EE的測定 根據單因素試驗結果，獲得天麻苷元脂質體的最佳處方工藝條件，按“1.2.5”項下方法測定最優工藝條件所制得天麻苷元脂質體的EE。

1.2.9最佳處方工藝條件下粒徑和PDI考察 根據單因素試驗結果，得最佳處方工藝條件，采用納米激光粒徑分析儀測定最優工藝所制得天麻苷元脂質體的平均粒徑、粒徑范圍和PDI。

2 結果

2.1 天麻苷元脂質體含量測定

專屬性試驗結果表明，天麻苷元對照品與天麻苷元供試品在色譜相應的位置上天麻苷元色譜峰保留時間一致，空白脂質體在天麻苷元相應出峰時間處無吸收峰，對測定無干擾，專屬性強，見圖1。以進樣量(X，ng)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制天麻苷元標準曲線，即得回歸方程為Y=3 597.90X+305.30(r=0.999 6)，表明天麻苷元在2.10～10.51 mg/L濃度范圍內，線性關系良好；精密度試驗峰面積RSD為1.26%(n=6)，表明儀器的精密度良好；重復性試驗峰面積RSD為1.48%(n=6)，表明該方法的重復性良好；穩定性試驗峰面積RSD為1.47%(n=6)，表明天麻苷元供試品溶液在24 h內穩定性良好；回收率試驗，平均加樣回收率為102.59%(n=6)，RSD為1.96%(n=6)，表明該方法回收率良好。

注：A為空白脂質體溶液，B為對照品溶液，C為供試品溶液，1為天麻苷元。圖1 對照品及供試品的HPLC色譜結果Fig.1 HPLC chromatogram of reference substance and sample

2.2 天麻苷元脂質體的制備

天麻苷元與大豆磷脂質量比例的考察結果顯示，質量比例為1 ∶2時，EE最小，平均粒徑及粒徑范圍最大；質量比例為1 ∶3、1 ∶4、1 ∶5的EE和平均粒徑差異不大；質量比例為1 ∶3時，PDI及粒徑范圍較小，因此選擇藥物與大豆磷脂質量比例為1 ∶3進行后續考察。大豆磷脂與膽固醇比例考察結果表明，大豆磷脂與膽固醇質量比例為5 ∶1時，EE最小，PDI及粒徑范圍最大；質量比例為3 ∶1或4 ∶1時EE和平均粒徑差異不大；但是當質量比例為3 ∶1時，PDI及粒徑范圍較小，因此選擇大豆磷脂與膽固醇質量比例為3 ∶1進行后續實驗考察。旋蒸溫度的考察結果顯示：溫度為50 ℃時，EE最小；溫度為40、60 ℃的EE差異不大；但當溫度為40 ℃時，平均粒徑和粒徑范圍較小，因此選擇旋蒸溫度為40 ℃進行實驗后續考察。水合溫度的考察結果顯示：溫度40、50、60 ℃的EE差異不大；40 ℃時，平均粒徑、PDI和粒徑范圍均較小；因此，選擇水合溫度為40 ℃進行后續實驗考察。水合時間的考察結果表明，水合時間為15 min時，EE最小，平均粒徑及粒徑范圍最大；時間為30、60 min的平均粒徑及粒徑范圍差異不大，由于水合時間為30 min時EE最大，PDI較小，因此選擇水合時間為30 min進行后續實驗考察。過0.1 μm濾膜次數的考察結果顯示，次數為3、5、7次的平均粒徑、PDI及粒徑范圍差異不大；鑒于次數為7次EE最大，因此選擇過0.1 μm濾膜次數為7次。

2.3 天麻苷元脂質體理化性質的初步研究

2.3.1脂質體的外觀 按最優處方制備的天麻苷元脂質體，外觀呈微帶淡藍色的乳白色混懸液，見圖2。

圖2 天麻苷元脂質體的外觀Fig.2 Appearance of Gastrodigenin liposomes

2.3.2脂質體的包封率 根據測得的峰面積，計算得最優處方工藝制備的天麻苷元脂質體EE為21%。

2.3.3脂質體的粒徑、粒徑范圍和PDI 采用馬爾文激光粒度測定儀，測得最優處方工藝制備的天麻苷元脂質體的平均粒徑為150.39 nm；粒徑范圍為31.84～688.63 nm；PDI為0.129。天麻苷元脂質體粒度分布較窄，見圖3。

圖3 天麻苷元脂質體的粒徑分布圖Fig.3 Particle size distribution of Gastrodigenin liposome

3 討論

本研究采用乙醇作為綠色溶劑，經典的薄膜分散法制備天麻苷元脂質體，方法簡單易操作[19-21]，也可應用于工業化大生產。在天麻苷元脂質體的處方中，膽固醇起到了膜流動性調節劑的作用，大豆磷脂與膽固醇比例的改變對成膜效果有著重要的影響；減壓回收溶劑成膜后，加入水化溶液，在一定的溫度下形成脂質體的效果較理想[22-24]。

本文研究考察了天麻苷元與大豆磷脂質量比、大豆磷脂與膽固醇質量比、旋蒸溫度、水合溫度、水合時間以及過濾膜次數，從而確定了最優處方制備工藝。脂質體粒徑范圍為31.84～688.63 nm，分布較窄且在水中分散較好，有效改善了天麻苷元的水溶性。

目前，脂質體制備用到的水化介質多為水或磷酸鹽緩沖液(具體選擇何種水化介質需根據藥物性質確定)，因此制備得到的大多數載藥脂質體均處于水系環境中，存在脂質體融合、藥物滲漏以及磷脂水解等問題，不適合長時間貯存[25]，下一步計劃將天麻苷元脂質體混懸液進一步制備為天麻苷元脂質體凍干制劑，以提高制劑的穩定性[26]。