PNU介導Seipin調控BV2細胞降解Aβ寡聚體的機制研究*

張捷， 何軍， 熊浪， 陳道慧， 彭寧， 黎婷婷， 任真奎,2， 禹文峰， 吳昌學

(1.貴州省第二人民醫院 檢驗科， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫科大學 分子生物學重點實驗室， 貴州 貴陽 550004)

阿爾茨海默病(AD)是一種好發于中老年人的癡呆性疾病，其病理表現為細胞外β-淀粉樣蛋白(amyloid-β，Aβ)聚集形成的老年斑塊(senile plaque，SP)、細胞內高磷酸化的tau蛋白組成神經纖維結節(intracellular neurofibrillary tangles，NFTs)、神經元壞死或功能失活及突觸受損等[1-2]。已知AD的病理機制有大腦神經元Aβ的異常聚集、神經炎癥、氧化應激和自噬功能失調等[3-4]。隨著對AD發病機制研究的不斷深入，科學家提出有效抑制大腦內Aβ的異常聚集，可能是治療AD的一個有效靶點[5-6]，但其療效也一直存在爭議。因此，尋找有效的小分子化合物或藥物調控清除腦內Aβ寡聚體對AD的治療具有一定的意義。PNU是α7煙堿型乙酰膽堿受體的激動劑，研究認為PNU在AD的動物模型、急性肺損傷模型及LPS誘導的神經炎癥模型等皆有保護作用，但是其確切的分子機制尚不清楚[7-8]。本課題組的前期研究發現，PNU能夠激活PI3K / Akt / mTOR自噬信號通路，且伴隨著Aβ水平的降低[9]。Seipin是一個定位于內質網上的多次跨膜蛋白，對脂滴的形態具有重要調控作用[10-11]，其突變導致2型先天脂肪營養不良；Seipin在中樞神經系統中高表達，在AD和缺血性腦卒中細胞、動物模型中均有研究報道[12]。研究發現Seipin可以調控細胞的自噬水平，并在Seipin N88S / S90L突變體轉基因小鼠中亦檢測到自噬的激活，突變體細胞內免疫熒光顯示自噬標志物微管相關蛋白1輕鏈3 (LC3)的亞細胞位置與突變的Seipin蛋白高度重疊[13-14]，提示Seipin與自噬存在聯系。因此，本研究擬用Aβ處理的BV2小膠質細胞(簡稱BV2細胞)模型探討PNU對BV2細胞Seipin蛋白表達、自噬功能，并探討分析二者之間相互調控的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

BV2細胞購于中科院上海細胞庫，PNU282987和Aβ藥物購自Sigma公司，LC3和Beclin-1抗體購自美國CST公司，Aβ抗體購自Gentex公司，Seipin抗體購自美國Abcam公司。Seipin shRNA慢病毒及陰性對照慢病毒購自上海吉凱基因生物公司，RNAi靶序列為GTAGAACTCTACTCTGACTAT，陰性對照插入序列為TTCTCCGAACGTGTCACGT。

1.2 研究方法

1.2.1BV2細胞的培養 將購買的BV2細胞凍存管放入之前預熱好的37 ℃恒溫水浴鍋中融化，避免慢融；將管內的細胞懸液轉入含完全培養基的15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min；丟棄上清液，再加入培養基重懸細胞，之后接種于培養瓶中，輕輕搖動培養瓶使細胞較散在地鋪于培養瓶底面，培養瓶置于5 % CO2、37 ℃的培養箱中進行培養；根據鏡下細胞狀態更換細胞培養基。

1.2.2CCK8法篩選Aβ最適造模濃度 Aβ作為誘導AD體外模型的藥物，用CCK-8法檢測不同濃度Aβ(0、0.1、1、5、10及30 μmol/L)對BV2細胞的損傷作用，參照實驗室前期實驗所使用的方法篩選Aβ最適濃度，處理24 h。

1.2.3病毒感染實驗 用Seipin shRNA慢病毒及陰性對照慢病毒感染BV2細胞，參照實驗室前期實驗所使用的方法，培養觀察細胞熒光，獲得陰性對照細胞與Seipin低表達細胞。

1.2.4細胞分組 根據1.2.2獲得的造模濃度，將細胞分為正常組(未做任何處理)和Aβ組(Aβ孵育24 h)，采用Western Blot檢測Aβ處理24 h細胞的Seipin蛋白表達水平。為了探索PNU對Aβ的抑制作用，將細胞分組為Aβ組(Aβ處理24 h)和Aβ+PNU組(5 μmol/L PNU處理細胞18 h、再加入Aβ孵育24 h)，觀察Aβ的表達情況；為了探索PNU對Seipin及自噬的影響，設置正常組(未做任何處理)與PNU組(5 μmol/L PNU處理細胞18 h)，觀察Seipin以及LC3和Beclin-1的表達情況；為了驗證慢病毒對Seipin的敲低效果，設置陰性對照組(非靶向性慢病毒)和si-Seipin組(靶向Seipin 的siRNA慢病毒)，用Western blot檢測Seipin表達水平；為了探索Seipin在PNU激活自噬及抑制Aβ過程中的重要性，設置陰性對照+Aβ組、陰性對照+Aβ+PNU組、si-Seipin+Aβ+PNU組，采用Western blot檢測Aβ和LC3的表達水平。

1.2.5Western Blot檢測蛋白表達水平 將上述各組細胞提取的蛋白樣品與適量5×Buffer混勻，沸水變性10 min，室溫冷卻備用；用12% SDS-PAGE凝膠以40 mA電流進行電泳，PVDF膜在冰浴中轉膜2 h，封閉液室溫封閉1 h, TBST洗滌2次，5 min/次；將實驗所用一抗4 ℃孵育過夜，之后TBST洗滌3次，5 min/次；再以相應二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，10 min/次，用ECL發光液進行顯色。用曝光儀獲取圖像結果，并用ImageJ計算灰度值，總蛋白以β-actin 為內部參照進行統計學分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 CCK8法篩選Aβ最適造模濃度

用不同濃度的Aβ處理BV2細胞，CCK8結果顯示：隨著Aβ濃度的增加，細胞存活率逐漸降低。與0 μmol/L相比，細胞經10 μmol/L的Aβ處理后其細胞存活率顯著下降30%；而在其他濃度下細胞受損較輕或較嚴重，均不適于誘導AD細胞模型來進行相關研究觀察。因此，選擇濃度為10 μmol/L Aβ作為建模濃度(圖1)。

注：與0 μmol/L比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。圖1 不同濃度Aβ處理的細胞存活率Fig.1 The survival rate of cells treated with different concentrations of Aβ

2.2 Aβ處理后BV2細胞中Seipin蛋白水平

在Aβ誘導的BV2細胞模型檢測Seipin蛋白的表達，結果顯示，經Aβ處理后BV2細胞中Seipin蛋白表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：(1)與正常組比較， P<0.05。圖2 各組BV2細胞中Seipin蛋白表達Fig.2 The expression of Seipin in each group

2.3 Aβ作用BV2細胞經PNU處理后Aβ表達

為了驗證PNU能抑制Aβ表達，BV2細胞經PNU處理18 h后，再用Aβ處理24 h；結果顯示，與Aβ組比較，PNU能夠減少Aβ的水平，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

2.4 BV2細胞經PNU處理后Seipin表達

為了探索PNU對Seipin表達的影響，在BV2細胞中加入PNU處理。結果顯示，與正常組比較，PUN組BV2細胞中Seipin蛋白表達增加，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

注：(1)與Aβ組比較， P<0.05。圖3 PNU處理后各組BV2細胞Aβ蛋白表達Fig.3 The expression of Aβ treated by PNU in each group

注：(1)與正常組比較，P<0.05。圖4 PNU處理后各組BV2細胞中Seipin蛋白表達Fig.4 The expression of Seipin treated by PNU in each group

2.5 BV2細胞經PNU處理后自噬相關蛋白表達

結果顯示，與正常組比較，PNU組BV2細胞自噬相關蛋白LC3和Beclin-1表達增加，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5。

注：(1)與正常組比較， P<0.05。圖5 PNU處理后各組BV2細胞中LC3和Beclin-1蛋白表達Fig.5 The expression of LC3 and Beclin-1 treated by PNU in each group

2.6 Seipin低表達細胞的鑒定

為了探索si-Seipin慢病毒對Seipin表達的影響，BV2細胞經si-Seipin慢病毒處理后，檢測到Seipin蛋白表達降低(P<0.05)。見圖6。

注：(1)與NC組比較， P<0.05。圖6 si-Seipin慢病毒對BV2細胞中Seipin表達的影響Fig.6 The effect of si-Seipin lentivirus on Seipin expression

2.7 低表達Seipin后LC3和Aβ的表達

結果顯示，與NC+Aβ組相比較，NC+Aβ+PNU組BV2細胞中Aβ明顯降低、LC3-Ⅱ明顯升高(P<0.01)；與NC+Aβ+PNU組比較，si-Seipin-Aβ+PNU組BV2細胞中Aβ明顯升高、LC3-Ⅱ明顯降低(P<0.01)。見圖7。

3 討論

癡呆類神經退行性疾病的特征是神經系統的進行性損害，例如導致認知能力下降的脆弱神經元群體的選擇性喪失。盡管每年都有報道全世界有數以百萬計的人受到影響，但仍然沒有藥物能夠阻止該疾病的過程或減慢疾病的進展。AD患者的神經元死亡與大腦內聚集的錯誤折疊蛋白Aβ有關[15-17]。機體有兩種主要的降解途徑——泛素-蛋白酶體系統和自噬-溶酶體途徑，可以清除細胞中不需要的或錯誤折疊的蛋白質，以防止其積累并維持細胞的功能[18-19]。隨著年齡的增長，蛋白酶體的降解和自噬功能顯著降低，因此，腦內大量的、具有神經毒性的Aβ和tau蛋白聚集體異常蓄積[20]。自噬是AD病理機制中研究的熱點內容之一，PNU作為其常用的研究藥物，也發現與自噬的調節密切相關，但是其具體的調控機制尚未完全清楚[21]。近年來，Seipin蛋白在神經系統疾病中的研究越來越多，被發現與細胞內一些功能密切相關，參與內質網應激通路的調控[22]。其次，報道也提出Seipin與自噬調控有關，此外，小膠質細胞是神經系統駐留的免疫細胞，具有吞噬、清除腦內異常代謝廢物或蓄積物質的功能[23-24]。探討PNU增強BV2細胞自噬途徑介導Aβ寡聚體的清除機制，對AD的有效治療具有重要意義。

注：(1)與NC+Aβ+PNU組比較，P<0.01；(2)與NC+Aβ組比較，P<0.01。圖7 各處理組Aβ和LC3蛋白表達水平Fig.7 The expression of Aβ and LC3 in each group

本研究中，BV2細胞用濃度為10 μmol/L的Aβ寡聚體處理構建AD細胞模型。經Aβ造模后細胞Seipin蛋白水平下降，在病理狀態下Seipin蛋白表達降低，提示Aβ抑制了BV細胞Seipin蛋白的表達。PNU處理能夠使細胞內Aβ蛋白減少，證明PNU通過降低Aβ發揮一定的神經保護作用。以上結果與之前研究報道一致[9]。為了闡明PNU的作用機制，在單獨加PNU處理的情況下，Seipin蛋白增加，自噬蛋白LC3和Beclin-1也增加。與之前PNU處理后能改善AD小鼠的學習記憶功能，Aβ聚集形成的斑塊減少，并發現了自噬溶酶體的存在，及Beclin-1表達增加的研究結果具有一致性[25]。本研究發現Seipin蛋白水平在PNU的處理下能夠上調，且在Aβ單獨處理下Seipin蛋白水平降低，此外，PNU能促進Aβ的降解，據此，推測PNU發揮神經保護作用的機制可能是上調Seipin蛋白，進而增強Seipin蛋白介導的自噬并降解Aβ寡聚體。為了進一步論證以上猜測，本研究進一步對BV2細胞進行慢病毒感染實驗敲低Seipin蛋白，再將該細胞與未干擾的細胞均進行Aβ和PNU處理，結果顯示Seipin缺少后與正常細胞相比其Aβ升高，LC3-Ⅱ降低，提示PNU的保護效應一定程度上依賴于Seipin的存在。

綜上所述，Aβ處理BV2細胞后Seipin降低，PNU能夠抑制Aβ的表達，PNU上調Seipin增強自噬降解Aβ是該效應的可能機制。