噴嘴型號的選擇對流式分選效果的影響

顧 云 張立霞 李淑珂

1 蓬萊區人民醫院 山東 蓬萊 265600；2 濱州醫學院基礎醫學院 山東 煙臺 264003； 3 濱州醫學院煙臺附屬醫院 山東 煙臺 264100

流式細胞分選技術是利用流式細胞儀，以高能量激光照射高速流動狀態下被熒光色素染色的單細胞或微粒，測量其產生的散射光和發射熒光的強度，根據實驗需求將目的細胞群分選出來。相對于機械法、免疫磁珠法、單細胞捕獲法等傳統細胞分離手段，具有分選參數多、分選群體多、分選純度高、靈活性強等優勢[1]，目前越來越多的實驗涉及到流式分選，分選顆粒種類也越來越多，有動物細胞、植物細胞[2-5]、微生物[6-8]及人工合成微粒等。要得到一個好的分選結果，在做流式分選的時候，不但要注意分選方案的選擇、初始細胞狀態、接收管處理等因素[9]，噴嘴的選擇也是影響分選結果的一個重要因素。目前常用的噴嘴型號有70、85、100、120等，研究用70，100兩種不同型號的噴嘴，觀察噴嘴對不同大小的顆粒、不同的熒光染色實驗分選的影響。

1 實驗試劑、分組與方法

1.1 實驗儀器 BDAria III流式細胞儀(BD公司，P64828200134)。

1.2 分選顆粒 BD Calibiite Bead(BD公司，23-3171-07)，Thp-1、H6和人外周血單核細胞(濱州醫學院饋贈)。

1.3 實驗試劑 人CD41-PE(BD公司，563562)，Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒(BD公司，556547)，Drop Delay Bead(BD公司，5271955)。

1.4 實驗分組 BD Calibiite Bead組：選取BD Calibiite Bead中的U，Apc和PE三種熒光微球各100 μL加至3 mL磷酸鹽緩沖液中。

Thp-1組：計數5×106個Thp-1細胞，放至60℃水中20 min造成細胞損傷，5 μL Annexin V-FITC和5ul PI染色20 min。

H6組：計數5×106個H6細胞，放至60℃水中20 min造成細胞損傷，Annexin V-FITC 5 μL和PI 5 μL染色20 min。

人外周血單核細胞組： 全血溶紅，淋巴細胞分離液分離出外周血中的單個核細胞，加人CD14-PE 5 μL染色30 min。

1.5 統計學方法 應用SPSS 25.0 統計軟件對實驗數據進行分析。使用χ2檢驗分析定性資料，P<0.05為差異有統計學意義。

2 實驗步驟

2.1 分選條件 分選條件調節(表1)，分選模式選擇純度模式(Purity)。

表1 70、100噴嘴的分選條件

2.2 四組樣本分別進行流式分選 使用70、100兩種不同型號的噴嘴，觀察上樣時液流的穩定性，包括側液流的連續性、是否出現斷流情況、Gap值的變化、正液流的分選點的穩定性。

收集所選門內的顆粒，將收集的顆粒進行流式檢測，觀察顆粒的位置的變化及檢測流式的分選純度。BD Calibiite Bead組分別收集PE陽性微球和APC陽性微球，Thp-1組收集Annexin V-FITC和PI雙陽性細胞，H6組收集Annexin V-FITC和PI雙陽性細胞，人外周血單核細胞組收集人CD14-PE陽性細胞。

單核細胞組PI染色，觀察單核細胞組分選后的細胞活性。

3 結果

3.1 不同組分別用70、100的噴嘴進行分選時的液流穩定性 分選液流穩定為“+”，出現管路堵塞、液流中斷；Gap值變化頻繁，上下液滴間移動；正液流中的分選點不穩定為“-” 。

3.2 不同組分別用70、100的噴嘴進行分選情況 與70噴嘴相比，100噴嘴的分選純度BD Calibiite Bead-PE組差異無統計學意義，Thp-1細胞組、H6細胞組、人單核細胞組分選純度高，差異有統計學意義(P<0.05)(圖1，表2)。

圖1 不同組分選后的純度的變化

表2 不同組分選后的純度(n=5，%)

3.3 分選后人外周血單核細胞的活性 人外周血單核細胞用70噴嘴和100噴嘴分選后細胞活性都在90%以上，用100噴嘴分選活性較70噴嘴高(圖2)。

圖2 人外周血單核細胞分選后細胞活性

4 討論

流式分選效果同流式細胞儀的機型，機器的維護，噴嘴的選擇，分選條件的選擇均有關系[10-12]。使用流式細胞儀進行分選時，細胞大小不超過噴嘴孔徑的五分之一，絕不超過三分之一。所以我們在進行細胞分選時就要有所選擇，像直徑較小的細胞或人工合成微粒，熒光抗體結合較穩定的實驗可以選擇小孔徑的噴嘴，因為小孔徑的噴嘴分選速度更快，分選純度也很好。對于干細胞、神經元、粒細胞這些脆弱或易激惹的細胞，要選用對細胞損傷相對較小的大孔徑的噴嘴。

細胞凋亡染色后分選，分選純度均不高，熒光素FITC、PI的平均熒光強度均有所降低，考慮在分選過程中，特別是打入接收管的過程中造成了結合在細胞表面的抗體脫落，像這種結合較不穩定的實驗要進行分選時最好選用大孔徑噴嘴，最低速度分選。

在合理使用噴嘴的同時做好噴嘴的護理。噴嘴在使用前和使用后均要置于純水中進行常規的超聲，以防止鞘液或分選顆粒黏貼至噴嘴“o”圈的內側造成液流不穩。但超聲時間盡量不要超過30 min鐘，超聲后放置于噴嘴架上晾干，不要長時間超聲或放置于純水中，否則容易造成噴嘴上“o”圈的脫落。如果“o”圈脫落，可以購置單獨的“o”圈，在每次分選前用扁頭棉簽沾水將其放置在噴嘴原位置使用。