免疫抑制受體igsf 9基因敲除鼠的構建以及對腫瘤生長的影響

孫 爽 劉祎璠 李尊嶺

濱州醫(yī)學院基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，山東省腫瘤免疫治療研究創(chuàng)新團隊 山東 煙臺 264003

免疫受體酪氨酸抑制基因序列(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)是由6個保守的氨基酸序列組成(I/L/V-x-x-Y-x-L/V)，其中酪氨酸(Y)殘基的磷酸化可以聚集下游的磷酸酶SHP-1、SHP-2或者SHIP-1，進而調控免疫細胞的活性。由于磷酸酶以抑制免疫細胞活性為主，因此含有ITIM的膜受體統(tǒng)稱為免疫抑制受體[1]。迄今為止，從人類蛋白組中鑒定出109個膜蛋白細胞內區(qū)域含有的ITIM基序[2]。

免疫球蛋白超家族成員9(immunoglobulin superfamily member 9，IGSF9)是2002年從小鼠胚胎中克隆出的一個新基因，包含5個Ig結構域、2個FnIII(III型纖連蛋白)結構域、跨膜區(qū)和胞內尾巴，其中細胞內908～913位點上的氨基酸殘基是經典的ITIM，因此IGSF9被列為免疫抑制受體家族成員[3-4]。在哺乳動物的胚胎發(fā)育時期，IGSF9主要表達在中樞神經系統(tǒng)的背根神經節(jié)、嗅覺上皮、三叉神經節(jié)和后腦神經上皮，主要功能與神經系統(tǒng)的運動以及抑制性神經遞質的傳遞有關[4]。IGSF9在子宮內膜癌中的表達是毗鄰正常組織的6倍以上，而且IGSF9表達越高，腫瘤肌層浸潤越明顯，患者預后越差[5-6]。缺氧誘導IGSF9的表達，降低igsf9基因表達后，鼻咽癌的生物學行為受到明顯抑制[7]。IGSF9除與神經系統(tǒng)的發(fā)育有關外，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但是IGSF9作為免疫抑制受體是否促進腫瘤的免疫逃避未見報道。

本研究應用CRISPR/Cas9技術，成功構建了igsf9基因敲除鼠，皮下接種Lewis肺癌細胞(LL/2)，繪制腫瘤生長曲線、流式細胞儀分析腫瘤組織中各免疫細胞的水平，初步探究IGSF9促進腫瘤免疫逃避的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 Lewis肺癌LL/2細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司(STR鑒定正確)。C57BL/6小鼠購自上海南方模式生物科技有限公司，飼養(yǎng)于濱州醫(yī)學院SPF級動物房，本項目所涉及動物實驗均獲濱州醫(yī)學院動物醫(yī)學倫理委員會批準(No.2018-19)。Anti-mouse CD3-FITC，Anti-mouse CD4-APC，Anti-mouse CD8-APC，Anti-mouse CD45-FITC，Anti-mouse-CD45-PE，Anti-mouse CD45-APC，Anti-mouse Ly6G-FITC， Anti-mouse Ly6C-APC，Anti-mouse F4/80-APC，Anti-mouse CD19-APC，Anti-mouse CD25-PE購自Biolegend公司。細胞計數(shù)器與細胞計數(shù)板購自美國伯樂公司，異氟烷購自深圳瑞沃德生命科技有限公司，細胞培養(yǎng)基購自Sigma-Aldrich公司，小鼠基因型快速鑒定試劑盒購自Transgene公司。

1.2 儀器 C6-Plus流式細胞儀購自BD公司，HR40-IIA2生物安全柜購自海爾公司，小型高速冷凍離心機購自Eppendorf公司，顯微鏡購自日本Olympus公司，HERAcell培養(yǎng)箱購自美國ThermoFisher公司，PCR儀購自Bio-Rad公司。

1.3igsf9基因敲除小鼠的構建

1.3.1 設計特異靶向RNA 設計igsf9的向導RNA(sgRNA)以及體外合成Cas9 mRNA應用CRISPR/Cas9網址，設計靶向igsf9外顯子4-9的特異sgRNA應用網址(https://zlab.bio/guide-design-resources)。序列如下：sgRNA1: GTCACACTGGTCATTCCCAG；sgRNA2: CCTAGGCTATTCTCAACCTC；sgRNA3: TTTAATTCAGCGCTGTGGTT；sgRNA4: GTTTAATTCAGCGCTGTGGT。igsf9基因敲除小鼠構建策略見圖1。通過體外轉錄的方式獲取Cas9 mRNA。顯微注射將Cas9 mRNA和igsf9-sgRNA注射到C57BL/6小鼠的受精卵中，獲得F0代小鼠。PCR擴增及測序鑒定陽性F0代小鼠，然后與野生型C57BL/6小鼠交配獲得F1代小鼠，F(xiàn)1代小鼠自交，獲得野生型以及敲除的純合子小鼠，野生型小鼠命名為C57BL/6-igsf9+/+，雜合子小鼠命名為C57BL/6-igsf9+/-，敲除的純合子小鼠命名為C57BL/6-igsf9-/-。

圖1 igsf 9基因敲除小鼠構建策略

1.3.2igsf9基因敲除小鼠的鑒定 根據(jù)sgRNA的敲除位點，本研究設計特異引物，應用PCR擴增目的條帶，小鼠基因型鑒定策略見圖2。引物序列如下：P1，CTCGAACGGTCCGGGAAATACAGA；P2，CAACACCACCGCCAGCCAAAAT；P3，GCTGCCTGCCTGGGTTGGACT；P4，GTGAGGGAGGGCAGAGGTAAGAAG。PCR反應體系如下：Lysate 4 μL，正向引物(10 μM)0.5 μL，反向引物(10 μM)0.5 μL，2×TransDirect Mouse Genotyping superMix 10 μL，純凈水 5 μL，總體積為 20 μL。PCR反應條件如下：94℃ 10 min，94℃30 s，55℃ 45 s，65℃1 min，重復 30 周期，65℃10 min。

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分別代表引物P1、P2、P3和P4的位置。

1.4 小鼠皮下成瘤實驗 將2×106個LL/2細胞接種到6周齡C57BL/6小鼠皮下，實驗分C57BL/6-igsf9+/+(n=3)、C57BL/6-igsf9-/-2組(n=5)。每3天測量腫瘤大小，繪制腫瘤生長曲線。當腫瘤體積大于2 cm3時，麻醉狀態(tài)下處死小鼠，剝離腫瘤組織，制備單細胞懸液。

1.5 流式細胞儀分析各免疫細胞水平 將上述單細胞懸液進行染色，各免疫細胞標志抗體如下：CD3+T細胞(鼠抗CD45-PE、鼠抗CD3-FITC)，CD4+T細胞(鼠抗CD45-PE、鼠抗CD3-FITC、鼠抗CD4-APC)，CD8+T細胞(鼠抗CD45-PE、鼠抗CD3-FITC、鼠抗CD8-APC)，中性粒細胞(鼠抗CD45-PE、鼠抗Ly6G-FITC、 鼠抗Ly6C-APC)，巨噬細胞(鼠抗CD45-PE、鼠抗Ly6G-FITC、鼠抗F4/80-APC)以及B細胞(鼠抗 CD45-FITC、鼠抗CD19-APC)。

1.6 統(tǒng)計學方法 應用Prism 7.0軟件進行統(tǒng)計學分析。定量資料以(±s)表示，采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 C57BL/6-igsf9+/+與C57BL/6-igsf9-/-小鼠的基因型鑒定 根據(jù)1.3.2小鼠基因型鑒定策略，以C57BL/6-igsf9+/+鼠尾作為模板，引物P3、P4能夠擴增出832 bp片段；以C57BL/6-igsf9+/-鼠尾作為模板，引物P1、P2能夠擴增出753 bp片段，引物P3、P4能夠擴增出832 bp片段；以C57BL/6-igsf9-/-鼠尾作為模板，引物P1、P2能夠擴增出753 bp片段，引物P3、P4不能擴增出片段。本研究對C57BL/6-igsf9+/+和C57BL/6-igsf9-/-小鼠進行基因型鑒定，結果見圖3。PCR結果顯示：在C57BL/6-igsf9+/+小鼠體內，引物P1、P2沒有擴增出條帶(泳道1、3、5)，引物P3、P4擴增出832 bp DNA片段(泳道2、4、6)；在C57BL/6-igsf9-/-小鼠體內，引物P1、P2擴增出753 bp條帶(泳道7、9、11、13、15)，P3、P4沒有擴增出DNA片段(泳道8、10、12、14、16)。

M為DNA ladder，1、3、5、7、9、11、13、15泳道代表P1和P2引物擴增的DNA片段(753 bp)；2、4、6、8、10、12、14、16代表引物P3和P4擴增的DNA片段(832 bp)。

為進一步明確C57BL/6-igsf9-/-小鼠體內敲除效果，本研究提取小鼠基因組DNA進行測序，序列比對見圖4。與C57BL/6-igsf9+/+測序結果相比較，C57BL/6-igsf9-/-DNA序列從1 321到4 209位點，出現(xiàn)明顯的缺失，缺失序列位于exon4-exon9之間，進一步表明本研究成功構建了igsf9基因敲除小鼠模型。

Query為野生型基因組序列；Subject為實際測序結果。

2.2 敲除igsf9基因后小鼠免疫細胞水平的變化 敲除igsf9基因后，與C57BL/6-igsf9+/+相比，C57BL/6-igsf9-/-小鼠的體質量無明顯變化(圖5 A)，CD8+T細胞、CD4+T細胞、B細胞以及巨噬細胞在外周血、脾臟以及骨髓中的比例無明顯改變(圖5 B、C、D)，表明敲除igsf9基因不影響小鼠的體質量以及各免疫細胞的水平。

在C57BL/6小鼠體內敲除igsf 9基因表達后，檢測小鼠的體質量(A)、外周血(B)、脾臟(C)以及骨髓中(D)各免疫細胞的水平。PB 代表外周血，SP代表脾臟，BM 代表骨髓。

2.3 C57BL/6-igsf9-/-小鼠對腫瘤生長的影響 將LL/2細胞皮下接種到C57BL/6-igsf9+/+和C57BL/6-igsf9-/-小鼠體內，從第5天開始測量腫瘤大小，然后每3天測量1次。腫瘤生長曲線、腫瘤大小和質量結果表明：與C57BL/6-igsf9+/+小鼠相比，C57BL/6-igsf9-/-小鼠體內腫瘤生長明顯受到抑制(圖6)。

A. 腫瘤生長曲線；B. 當腫瘤超過2 cm3時，處死小鼠后剝離腫瘤組織；C. 稱重腫瘤組織，***P<0.001。

2.4 C57BL/6-igsf9-/-小鼠腫瘤組織中CD3+T細胞水平的變化igsf9屬于免疫抑制受體家族成員，在小鼠體內敲除igsf9基因的表達，有可能激活小鼠免疫系統(tǒng)進而抑制腫瘤的生長。流式細胞儀檢測各免疫細胞在腫瘤組織中的水平，結果顯示：C57BL/6-igsf9-/-小鼠腫瘤組織中的CD3+T細胞、CD3+/CD4+T細胞以及CD3+/CD8+T細胞水平均顯著高于C57BL/6-igsf9+/+小鼠腫瘤組織相應細胞的水平，P<0.05(圖7 A、B、C)；在兩組小鼠腫瘤組織中，B細胞、中性粒細胞以及巨噬細胞水平差異均無統(tǒng)計學意義(圖7 D、E、F)。這表明，小鼠體內敲除igsf9基因表達能夠促進更多的CD3+T細胞浸潤到腫瘤組織，或者促進腫瘤組織中CD3+T細胞的增殖，進而抑制腫瘤細胞的生長。

A. CD3+ T細胞；B. CD3+/CD4+ T細胞；C. CD3+/CD8+ T細胞；D. B細胞；E. 中性粒細胞；F. 巨噬細胞。*P<0.05。

3 討論

以PD-1/PD-L1為靶點的腫瘤免疫治療藥物在臨床上取得了巨大的成功，讓腫瘤患者看到了治愈的希望[8]。目前我國FDA已經批準了PD-1/PD-L1單克隆抗體治療肺癌、黑色素瘤、尿路上皮癌、頭頸部鱗癌、結腸癌、淋巴癌、腎癌等腫瘤，但是患者受益率從5%到40%不等，約20%的患者能夠從中受益[9]，意味著80%的腫瘤患者有自己獨特的免疫逃避方式，探討和發(fā)現(xiàn)新的腫瘤免疫逃避機制，是科研工作者和臨床醫(yī)生面臨的重大挑戰(zhàn)。

IGSF9是進化上高度保守的蛋白，生物信息學分析表明IGSF9與神經細胞黏附分子(nerve cell adhesion molecules，NCAM)結構相似，都有5個免疫球蛋白結構域、2個III型纖連蛋白結構域、跨膜區(qū)以及胞內序列。IGSF9主要表達在胚胎發(fā)育時期，在人類發(fā)育的第8周到第14周、小鼠胚胎發(fā)育的第7.5天到16.5天，能夠檢測到IGSF9的表達，在成年人正常組織中，沒有檢測到IGSF9基因的表達。由于IGSF9主要表達在胚胎發(fā)育時期的神經系統(tǒng)，因此，IGSF9在突觸的形成和傳遞中的作用報道較多[10]。IGSF9在子宮內膜癌和鼻咽癌中表達水平較高，與病人的預后密切相關[7-8]。

本研究前期查詢了TCGA以及The human protein atlas數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)IGSF9在大多數(shù)腫瘤組織中都有表達，但是IGSF9在腫瘤發(fā)生中的作用未見報道。IGSF9細胞內有經典的ITIM基序，屬于免疫抑制受體超家族成員，其是否通過抑制免疫系統(tǒng)促進腫瘤免疫逃避未見報道。本研究首先設計靶向igsf9的特異向導RNA(sgRNA)，利用CRISPR/Cas9技術，向小鼠受精卵中注射igsf9-sgRNA以及Cas9 mRNA, PCR以及測序結果顯示：在C57BL/6小鼠體內成功敲除了igsf9基因的表達，構建了igsf9敲除小鼠。接下來，本研究利用igsf9野生型和基因敲除鼠，皮下注射LL/2細胞，構建小鼠皮下成瘤模型。腫瘤生長曲線和腫瘤質量表明：在小鼠體內敲除igsf9基因的表達，能夠顯著抑制腫瘤的生長。由于IGSF9屬于免疫抑制受體家族成員，因此本研究分析了腫瘤組織中各免疫細胞的水平，發(fā)現(xiàn)浸潤到腫瘤組織中的CD3+T細胞、CD3+/CD4+T細胞、CD3+/CD8+T細胞水平顯著升高，而B細胞、中性粒細胞和巨噬細胞水平沒有變化。CD3+T細胞是腫瘤免疫中最重要的細胞，也是殺傷腫瘤的主要細胞。本研究表明：敲除igsf9基因表達后，一方面有可能是促進了更多CD3+T細胞浸潤到腫瘤組織；還有可能是早期浸潤到腫瘤組織中的CD3+T細胞被激活、擴增。基于以上分析，本研究后期將深入探討IGSF9與CD3+T細胞之間的相互關系，并闡明相應的機制。

本研究有望發(fā)現(xiàn)一個新的腫瘤免疫治療靶點，為腫瘤免疫治療藥物的研發(fā)提供實驗依據(jù)。